Моделирование нейронных иммунной сигнализации эпизодической и хронической мигрени Использование распространяющейся депрессии In Vitro

Цель этого видео — проиллюстрировать, как культуры срезов гиппокампа могут быть использованы для расшифровки нейронной иммунной сигнализации, которая модулирует восприимчивость к распространяющейся депрессии, наиболее вероятной основной причине мигренозной ауры и, возможно, мигренозной головной боли. Распространяющаяся депрессия легко вызывается в культурах срезов гиппокампа. Поскольку культуры хранятся in vitro в течение нескольких недель, поведение отдельных типов клеток можно измерять, имитировать и модулировать в течение длительных периодов времени.

Это особенно важно для изучения нейронной иммунной сигнализации. Поскольку зрелые срезы мозга гиппокампа достигают спокойного иммунного состояния, иммунные реакции распространяющейся депрессии могут быть оценены без потенциально искажающих эффектов анестезии с использованием современных молекулярно-биологических методов. Таким образом, может быть определено чувствительное обнаружение сигналов цитокинов от всего лишь 50 клеток до приблизительно 90 000 клеток в срезе.

Культуры срезов мозга гиппокампа идеально подходят для использования в разработке новых нейроиммунных терапевтических средств для облегчения мигрени. Меня зовут Йян Берг, а это Айя Пусс и Хайди Митчелл из лаборатории Ричарда Крейга и отделения неврологии Медицинского центра Университета Чикаго. Сегодня мы продемонстрируем использование гиппокампа крыс, вшей, культур, а также изучение низкого уровня иммунной сигнализации распространяющейся депрессии.

Распространяющаяся депрессия — это пароксизмальное нейронное событие, которое запускается взрывом повышенной синаптической активности, за которым быстро следует временная потеря всей активности. Все больше доказательств показывает, что низкий уровень иммунной сигнализации может влиять на синаптическую активность в мозге и, в свою очередь, подвергаться ее влиянию. Мы предполагаем, что цитокины модулируют восприимчивость к распространяющейся депрессии и, как следствие, к мигренозной ауре и, возможно, к мигренозной головной боли.

Процедуры, которые мы описываем здесь, предназначены для минимизации потенциально искажающей активации иммунных клеток и повышения нашей способности обнаруживать низкий уровень иммунной сигнализации. Это позволяет нам обнаружить широчайший спектр нейронных иммунных сигналов и их взаимодействие с распространяющейся депрессией. Для начала этой процедуры изготовьте заземляющие электроды, разрезав стеклянные трубки до длины 4,5 миллиметра.

Затем кратко отполируйте вырезанные участки с обоих концов. Далее доведите до кипения 100 миллилитров одного моляра хлорида калия, добавьте в него 3,5 грамма агара и 0,5 грамма ЭДТА. Непрерывно помешивайте смесь до получения прозрачного желтого раствора.

Наденьте на каждую стеклянную трубку кусок короткой гибкой трубки. Затем наберите теплый раствор хлорида калия в стеклянную трубку и на небольшое расстояние в гибкую трубку. Отпустите всасывающее вещество и дайте агару с хлоридом калия медленно капнуть из открытого кончика стеклянной трубки.

Когда агар вытекает, коснитесь кусочка льда кончиком открытой стеклянной трубки, что побудит агар загустеть на кончике электрода, а не гелеобразить после того, как он вернется обратно в стеклянную трубку. После того, как агар будет желеобразным, аккуратно снимите гибкую трубку, не меняя положения агры. В стеклянные пробирки поместите 0,5 миллилитра одного моляра хлорида калия в каждую лунку штатива для центрифужных пробирок объемом 1,5 миллилитров.

Затем поместите кончик каждой стеклянной трубки с хлоридом калия в отдельные лунки, чтобы кончики оставались влажными. Далее держите серебряную проволоку длиной 80 сантиметров 15 калибра с гемостатом. Очистите каждую из четырех сторон, соскребая проволоку через наждачную доску, прикрепленную к столешнице.

После этого разрежьте проволоку на отрезки по четыре сантиметра. Положите их в сцинтилляционный флакон, наполненный отбеливателем, на 20-30 минут. Для того, чтобы нанести прочное покрытие из хлорида серебра на очищенную поверхность серебра, согните проволоку пополам и вставьте ее в стеклянную трубку, заполненную агаром хлорида калия, оставив от четырех до шести миллиметров открытой.

Затем покройте кончик стеклянной трубки, содержащий серебряную проволоку и небольшую часть проволоки, слизью, водостойким и гибким клеем, чтобы предотвратить высыхание агара хлорида калия, повторите для всех электродов и дайте клею высохнуть в течение ночи. После рисования храните электроды в сцинтилляционных флаконах с пятью миллилитрами одного моляра хлорида калия и 25 миллиграммами ЭДТА. Около пяти-шести электродов на флакон при четырех градусах Цельсия.

Изготовьте записывающие электроды с помощью трубок из босиликатного стекла с нитями накаливания. Далее изготовьте стимулирующий электрод, вырезав примерно на 20 сантиметров платиновый меридиум с тефлоновым покрытием. Затем согните длину пополам, свободные концы свяжите в свободный квадратный узел, оставив около двух сантиметров от узла до концов проволоки.

Закрепите узел в патроне электродебри, поставленной на стол, при этом придерживая другой конец проволоки гемостатом. Кратковременно включайте и выключайте дрель до тех пор, пока проволока не будет туго скручена. Чтобы прикрепить скрученные провода из платинового меридия к подводящим проводам, сначала примотайте скрученный провод из платинового меридия к столешнице и капните лужу концентрированной соляной кислоты на один свободный конец скрученного провода.

Затем поместите зачищенный конец на подводящий провод, примыкающий к скрученному концу провода, и придайте тепло от паяльника с тонким наконечником, затем паяйте, пока два провода не будут прочно прикреплены. Наденьте короткий отрезок термоусадочной трубки на открытое соединение провода и сожмите его с помощью теплового огня. Отполируйте кончик пипетки на расстоянии 15 сантиметров от пипетки и проведите скрученный платиновый меридиан проволокой вниз по пипетке.

Используйте водоотталкивающую эпоксидную смолу для герметизации обоих концов электрода. Наконец, прикрепите банановые вилки к концам подводящего провода для подключения к изолятору стимулов под стереоскопическим наблюдением. Поместите наконечник электрода в PBS и ищите электролитические пузырьки, исходящие только от срезанного конца кончиков электродов, если какие-либо пузырьки приходят с боков скрученных проводов.

Разрежьте электрод поперечно с помощью лезвия бритвы с одной кромкой, чтобы восстановить неповрежденную изоляцию длинных осей проводов. При устранении неполадок для устранения эффектов аберрантного стимула попробуйте изготовить только что вырезанный наконечник электрода. Еще одним важным этапом является подготовка записывающих чашек, которые состоят из вкладыша для срезов и 35-миллиметровой чашки для культуры, которая сидит на двух стеклянных стержнях размером 1,0 x 12 мм, расположенных на расстоянии около 1,0 сантиметра друг от друга.

Стеклянные стержни прикрепляются к основанию посуды путем нагревания стеклянных трубок и последующего вдавливания их в основание с помощью щипцов. Для статичной записи добавьте в тарелку 1,5 миллилитра носителя. После этого замочите кусок стерильной ваты шириной 10 миллиметров и длиной три-четыре сантиметра.

В 1,0 миллилитрах среды сложите вату пополам по длинной оси и положите вдоль внутренней стенки на вкладыш. С помощью стерильных щипцов влажная вата помогает поддерживать влажность посуды. Три сжимаемых куска трубки длиной четыре миллиметра расположены на равном расстоянии вокруг вставки.

Плотно накройте посуду поливинилхлоридной пленкой, чтобы обеспечить газообмен. Затем разрежьте его среднюю вертикальную стенку лезвием бритвы с одной кромкой, чтобы удалить излишки поливинилхлорида. Пленка вызывает около трех полевых потенциалов с импульсами 100 микросекунд с частотой 0,2 герца, начиная с тока от одного до пяти микроампер, которого достаточно для запуска ответа.

Перемещайте записывающий электрод с шагом вдоль длинной оси параметаллического нейрона до тех пор, пока потенциал поля не станет максимальным. Затем увеличьте ток с помощью записывающего электрода в этом положении и обратите внимание на максимальную реакцию тока от 10 до 20 микроампер. Наконец, используйте половину максимальной интенсивности стимула для экспериментов, чтобы определить порог транссинаптически вызванной распространяющейся депрессии.

Переключите парадигму стимуляции, чтобы вручную вызывать одиночные всплески по 100 микросекунд на импульс с частотой 10 Гц. Постепенно увеличивайте интенсивность тока для каждого всплеска стимула до тех пор, пока не будет вызвана распространяющаяся депрессия. Сообщайте о распространении порога депрессии в люмах каждые девять минут в течение часа.

Запись быстрых и медленных изменений потенциалов в трех зонах с помощью отдельных цифровых систем обработки сигналов. После последнего углубления разбрасывания верните культуральную вставку в нормальные условия инкубации и отметьте крышку чашки для культуры. Чтобы отметить культуру, которая испытала распространение депрессии, меняйте среду каждые три-четыре дня до сбора урожая культуры.

Начните эту процедуру с разбавления селектина ISO до 20 микрограмм на миллилитр в питательных средах. Затем инкубируйте культуры срезов в нормальных условиях инкубации за четыре-10 часов до получения изображения, включите микроскоп, камеру, контроль температуры ультрафиолетового излучения и газов по крайней мере за час до получения изображения. Затем настройте программное обеспечение метаморфа для визуализации, после чего поместите вставку в 35-миллиметровую чашку для культур с двумя одномиллиметровыми стеклянными стержнями на дне.

Затем между стенками вкладыша и чашкой для культивирования втягиваются три двухмиллиметровых кусочка резиновой трубки. Для дальнейшей стабилизации вкладыша поместите внутрь вкладыша кусок ваты шириной 10 миллиметров, смоченный дополнительно в одном миллилитре среды. Для поддержания увлажненной среды сверху посуду для культуры плотно накройте пленкой из поливинилхлорида.

Чтобы предотвратить потерю жидкости, убедитесь, что фокус изображения находится на слое трех параметаллических клеток CA. Обратите внимание на ориентацию срезов, делая фазовые снимки с пятью x 10 x и 20 x в окне точной фокусировки, установите текущий диапазон равным восьми и точность одним щелчком найдите фокус, чтобы обеспечить сфокусированное изображение в окне получения интервальной съемки. Выберите временной интервал в одну минуту и продолжительность в шесть часов для точного захвата движений микроглии.

Визуализация должна производиться не реже, чем раз в минуту в конце фильма. Проверьте наличие повреждений клеток с помощью скрининга CY talk для экспериментов с ПЦР. Погрузите срезы культуры в два-три миллилитра РНК позже и храните их при температуре четыре градуса Цельсия до трех дней до дальнейшей обработки.

Для заготовки удалите посторонние ткани с помощью стеклянного ножа, разложите срезы по отдельным РНК. Свободные ДНК 1,5 миллилитровые центрифужные пробирки, содержащие 0,5 миллилитров стерильного фосфатного буферного раствора. Используя кисть с тонким наконечником, отжимайте образцы, 10 000 об/мин в течение одной минуты стереотипным образом, чтобы все ломтики прилипли к одной и той же стороне своих трубок.

Удалите надосадочную жидкость PBS и повторно суспендируйте образец в 500 микролитрах триола. Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия или держите на льду до экстракции РНК Изменения экспрессии белка от нокдауна SI РНК можно чувствительно оценить, усилив традиционное иммуноокрашивание DAB путем интенсификации серебра и последующего количественного определения метрики densi. Здесь показана парадигма электрофизиологической записи культуры среза, в которой записывающий микроэлектрод помещается в слой трех параметаллических нейронов CA, а биполярный стимулирующий электрод помещается в зубчатую извилину.

Вот пример вызванных КА трех полевых потенциалов при стимуляции зубчатой извилины, который используется для установления половины максимального отклика. Здесь показаны три полевых потенциальных ответа КА на оставшиеся всплески в 10 герц, которые постепенно увеличивались по интенсивности, чтобы в конечном итоге вызвать распространяющуюся депрессию. В правом нижнем углу. Здесь показана образцовая жизнеспособная иммунная клетка.

Это изображение впервые демонстрирует, что часть микроглии перемещается на большие расстояния по оптимальной схеме поиска, обозначенной красным цветом, известной как полеты леви, которые обратно пропорциональны синаптической активности. Преемная амплификация CDNA позволяет обнаруживать гамма-ИФН в культурах срезов гиппокампа. Первоначально КТ для референсного гена RPL 13 A составлял 20,5, а гамма ИФН была неопределяемой слева.

Однако после усиления Преима, указанного справа, гамма ИФН была легко обнаружена на уровне 29,0. При регистрации RPL 13 A на уровне 14,1 указывает на 12-кратное увеличение усиления сигнала, иммуногистохимическое подтверждение эффективности показано здесь. Дифференцированное интенсификация серебра пероксидазой диамин бензиновым иммуноокрашиванием используется для количественной оценки значительного снижения продукции циклофилина B в культурах среза гиппокампа, обработанных миРНК.

Техники, описанные в этом видео, можно выполнять в течение нескольких дней. Мы хотим подчеркнуть, что наши культуры срезов гиппокампа очень близки к их аналогам in vivo и идеально подходят для изучения иммунной сигнализации и распространения депрессии. Тем не менее, важно поддерживать спокойную иммунную среду под контролем и в фиктивных условиях.

Чтобы свести к минимуму искажающую иммунную активацию, бактериологическое исследование должно поддерживаться в стерильных условиях. Они не должны подвергаться чрезмерным химическим, механическим или термовозмущениям. Поскольку физиологическая передача сигналов цитокинов происходит на фемтомолярном уровне, необходимо применять высокочувствительные и воспроизводимые методы измерения.

Мы используем технологию PCRA и чувствительные протеомные техники. Наконец, цитокины являются как плейотропными, так и избыточными. Соответственно. Мультиплексные цитокиновые мишени, измеренные с течением времени, полезны для изучения того, как иммунная сигнализация модулирует восприимчивость к депрессии растяжения связок и, как следствие, к мигрени.