Высокая пропускная способность На месте Гибридизация метод для характеристики Шаблоны экспрессии мРНК в фетальных Мышь Нижняя урогенитального тракта

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации паттернов экспрессии мРНК в тканях развивающегося нижнего мочеполового тракта плода мыши. Это достигается путем первоначального синтеза рибозонда, меченного диоксигенином, на основе матрицы, полученной методом ПЦР. Вторым этапом процедуры является изготовление толстых срезов с использованием вибротома.

Третьим этапом является проведение гибридизации in situ в срезах нижних мочеполовых путей, помещенных в специальные кассеты. мРНК визуализируют с помощью иммуногистохимического детектирования связанных рибозондов с использованием осаждающего субстрата щелочной фосфатазы BM purple. В конечном итоге с помощью микроскопии можно определить пространственную и временную локализацию транскриптов мРНК с низким и высоким уровнем экспрессии в нижних мочеполовых путях плода мыши.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как иммуногистохимия, является то, что рибозонды легко создавать, и их можно адаптировать для распознавания большинства мРНК во всем геноме мыши. Хотя этот метод позволяет изучить паттерны экспрессии мРНК в процессе развития мочеполовой системы плода мыши, он также может быть применен к другим системам органов, видам и стадиям развития. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку освоить технику заливки ткани в агар может быть сложно, а незначительные отклонения в ориентации образца могут привести к противоречивым результатам. Минимум за один день до подготовки ткани удалите и выбросьте мембрану из многолуночного планшета для культур клеток диаметром 12 мм; оставшееся кольцо будет служить формой. Замочите кольца на ночь в растворе ингибитора РНК.

В день проведения протокола препарируйте нижние отделы мочеполовой системы мыши, подвергнутые регидратации в градуированном метаноле. После промывки в растворе PBS-Tween удалите примерно две трети мочевого пузыря, а оставшуюся ткань нижних отделов мочеполовой системы поместите в PBS-Tween. Затем установите обработанную кольцевую форму на предметное стекло микроскопа, заполните ее 4% раствором низкоплавкой агарозы при 62 °C и дайте остыть в течение примерно двух минут.

Теперь промокните ткань нижних отделов мочеполовой системы насухо и погрузите её в раствор agarose. С помощью пинцета расположите ткань так, чтобы она находилась в подвешенном состоянии посередине кольца. Инкубируйте форму при температуре 4 °C до полного затвердевания agarose.

Перед нарезанием ткани подготовьте специальное лезвие Уилкинсона, промыв его растворителями, а затем водой. Разделите двойное лезвие вдоль на два одинарных. Затем закрепите лезвие Уилкинсона с помощью ножа микротома.

Для этого сначала обрежьте лезвие микротома до длины лезвия Уилкинсона. Затем, используя адгезив Lock Tite, приклейте лезвие микротома к лезвию Уилкинсона со смещением от режущей кромки примерно на три-четыре миллиметра. Теперь установите усиленное лезвие в вибромикротом и установите угол наклона лезвия на 35 градусов.

Подготовьте ванночку для образцов, наполнив ее PBS и обложив вокруг мокрым льдом. Перед установкой ткани, заключенной в пробку, извлеките ее из кольцевой формы и просушите нижнюю поверхность блоком. Затем приклейте просушенную поверхность к монтажному диску с помощью клея Loctite.

Вставьте диск в вибротом и установите толщину среза 50 мкм, скорость на значение 2, а амплитуду лезвия — на значение 4. При нарезании срезов ткани используйте тупые пинцеты для переноса каждого среза в 24-луночный культуральный планшет, заполненный 0,5 мл ледяного PBS tween. После нарезания, перед началом гибридизации INI, удалите большую часть агароза вокруг каждого среза ткани с помощью пружинных ножниц; срезы можно хранить до 48 часов при 4 °C в PBS tween, содержащем 2 мМ азида натрия.

Сначала изготовьте специальные корзинки для образцов, отрезав дно микроцентрифужной пробирки на отметке 100 µL. Нагревайте место среза пробирки в пламени, пока пластик не размягчится. Затем плотно прижмите размягченный пластик к квадрату из сетки.

Дайте материалу затвердеть и обрежьте излишки сетки. Завершите изготовление корзин, проделав с помощью нагретой иглы 18 калибра по два отверстия в каждой крышке трубки. Изготовьте лоток для размещения корзин с образцами, просверлив в крышке 24-луночного планшета 24 равномерно распределенных отверстия диаметром 12 мм.

Перед началом работы каждое отверстие должно быть расположено точно над лункой; затем следует начать предварительный нагрев закрытой гибридизационной камеры, заполненной водопроводной водой на глубину примерно 1,3 см, до 60.5 °C. Приступите к гибридизации in situ, добавив по 2 мл PBS tween в каждую лунку 24-луночного культурального планшета. Накройте этот планшет подготовленной крышкой с установленными корзинками.

Теперь перенесите срезы ткани в кассеты при комнатной температуре и инкубируйте их в 6% перекиси водорода с PBS-Tween на качалке, после чего проведите серию промывок с PBS-Tween, инкубацию с протеиназой K, повторную фиксацию и дополнительные промывки. Для завершения подготовки образцов добавьте по 2 мл предварительно нагретого буфера для прегибридизации в каждую лунку и инкубируйте планшет в нагреваемой гибридизационной камере не менее одного часа. Запустите процесс гибридизации, добавив по 0,5 мкг меченого RIBA-зонда в каждую лунку.

Затем продолжите инкубацию в течение ночи в нагреваемой гибридизационной камере. На следующий день промойте ткани раствором один, постепенно переходя к раствору два, после чего обработайте их РНК. Затем промойте в растворе три, после чего выполните промывки в TBS tween и блокирующем буфере для тканей, пока ткани инкубируются в блокирующем буфере для тканей.

По истечении периода инкубации начните инкубацию антител к дигоксигену в буфере для абсорбции антител при температуре 4 °C продолжительностью не менее двух часов. Центрифугируйте раствор антител при 10 000 об/мин в течение одной минуты. Для удаления нерастворимых веществ добавьте сенну к 2 мл буфера для раствора антител.

Теперь извлеките ткань из блокирующего буфера и инкубируйте ее в приготовленном растворе антител. Оставьте образцы в камере для гибридизации на ночь при температуре 4 °C на третий день процедуры. Несколько раз промойте ткани в TBST с использованием ole.

Затем с помощью стеклянной пастеровской пипетки осторожно перенесите ткани в чистые микроцентрифужные пробирки. Промойте ткани в течение 10 минут, используя 1 mL пустого NTM.

Затем замените раствор на TMT, содержащий lava sole MBM purple. Поместите пробирки в темное место и в течение следующих нескольких дней контролируйте развитие окраски, при необходимости заменяя раствор. После полного развития окраски краткосрочно промойте ткани раствором TMT, содержащим lava so, а затем инкубируйте их в течение ночи при четырех градусах Celsius в PBS, содержащем para formaldehyde.

На следующий день ткани подвергают обесцвечиванию и промывке. Теперь срезы готовы к визуализации. Ткань нижних мочевыделительных путей была залита в агар таким образом, чтобы срединная линия уретры была параллельна плоской поверхности пробки aros.

Такая ориентация позволила получить сагиттальные срезы. Специально изготовленные корзинки для образцов защищали хрупкие срезы тканей от пыли и твердых частиц в ходе многодневной процедуры гибридизации in C two.

Они также предотвратили потерю любых срезов. Ограничить фоновое окрашивание при длительных инкубациях, необходимых для обнаружения мРНК с низкой экспрессией, довольно сложно. Однако добавление азида натрия с последующей фильтрацией, по-видимому, позволило ограничить фоновое окрашивание.

Кроме того, при инкубации образцов в растворе для проявления цвета в течение длительного времени видимых различий в фоновом окрашивании не наблюдалось. При должном исполнении и освоении данной методики процедуру можно завершить за шесть дней. После выполнения данного протокола можно применить другие методы, например, иммуногистохимию, чтобы определить, коррелирует ли паттерн экспрессии мРНК с паттерном экспрессии белков.

После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как визуализировать паттерны экспрессии мРНК в развивающемся нижнем отделе мочеполового тракта мыши.