In Vitro Система по изучению опухолей покоя и Переключить на рост метастазов

Общая цель следующего эксперимента заключается в наблюдении в режиме реального времени и с высокой пропускной способностью за влиянием потенциальных агентов на состояние покоя опухолевых клеток и/или их выход из этого состояния с использованием следующего анализа in vitro для моделирования покоя опухоли или перехода к метастатическому росту. Это достигается путем первоначального культивирования покоящихся и/или метастатических опухолевых клеток в трехмерной культуре на основе экстракта базальной мембраны (BME), адаптированной для платформы с 96-луночным планшетом. При культивировании в этой 3D-системе метастатические клетки переходят в транзиторную, покоящуюся или квазипокоящуюся фазу.

Напротив, опухолевые клетки, находящиеся в состоянии покоя in vivo, переходят в состояние длительного квиесценции. В системе 3D-культивирования метастатические клетки можно подвергать воздействию потенциальных препаратов, чтобы предотвратить их переход из состояния квиесценции к пролиферации. В то же время спящие опухолевые клетки можно обрабатывать потенциальными агентами, которые могут индуцировать их переход из состояния квиесценции к пролиферации.

Пролиферативную активность покоящихся и метастатических клеток в результате лечения будут оценивать, используя набор для анализа пролиферации клеток CellTiter-96 Aqueous One Solution в заданные моменты времени с последующим анализом на планшетном ридере для ИФА. Полученные результаты покажут влияние терапии на пролиферацию покоящихся или метастатических опухолевых клеток на основе анализа пролиферации в 3D-системе. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метастазирования, такие как то, какие факторы и клеточные механизмы поддерживают диссеминированные опухолевые клетки в состоянии покоя, а также какие факторы и клеточные механизмы индуцируют переход от покоя опухоли к клиническому метастазированию.

За сутки до проведения анализа пролиферации поместите BME с пониженным содержанием факторов роста в холодильник при температуре 4 °C на ночь. Затем, в день проведения анализа, выберите для эксперимента культуру клеток спящей или метастатической опухоли. Далее поместите 96-луночный планшет на подложку со льдом внутри ламинарного шкафа.

Затем с помощью дозатора со шприцем нанесите в каждую лунку планшета по 50 µL размороженного ледяного BME. Убедитесь, что в лунках не образовались пузырьки воздуха; поместите 96-луночный планшет, покрытый BME, в увлажненный инкубатор с 5% carbon dioxide при 37 °C на 30 минут. Тем временем, пока планшет с BME находится в инкубаторе, поместите флакон с трипсином при 37 °C для прогрева.

Отоспирируйте среду из культуры опухолевых клеток. Промойте культуральные планшеты 10 миллилитрами PBS. Затем отоспирируйте PBS и добавьте в планшеты два миллилитра предварительно нагретого трипсина.

Инкубируйте планшеты в течение пяти минут. Добавьте 5 mL DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненного 10% FCS и антибиотиками, в коническую пробирку объемом 15 mL. В течение этого времени.

После инкубации перенесите отделенные клетки в пробирку объемом 15 миллилитров и подсчитайте количество клеток. Затем центрифугируйте всю суспензию клеток, предназначенную для культивирования, в центрифуге для культур тканей в течение пяти минут при 1500 G при комнатной температуре. Осторожно аспирируйте супернатант.

Оставьте немного среды, так как в большинстве случаев осадок не виден. Затем постучите по дну пробирки, чтобы обеспечить получение суспензии из одиночных клеток. Далее ресуспендируйте осадок в 100 µL assay media на каждые 2 × 10³ клеток.

Несколько раз тритурируйте клетки с помощью пипетки объемом 5 мл, чтобы обеспечить поддержание суспензии из одиночных клеток. В лунки 96-луночного планшета, покрытого BME, внесите по 100 µL клеточной суспензии на лунку. Для контрольного планшета вычитания фона в несколько лунок 96-луночного планшета, покрытого BME, внесите по 100 µL только assay media. Затем инкубируйте планшеты, аспирируйте старую среду и каждые четыре дня заменяйте ее новой assay media.

Для оценки пролиферации клеток в каждую лунку 96-луночного планшета, анализируемого в выбранный временной точке эксперимента, добавьте по 20 µL водного раствора Cell Titer 96 из набора для анализа пролиферации клеток. Инкубируйте планшеты в течение двух часов. Затем с помощью планшетного ридера для ИФА измерьте оптическую плотность как в опытных, так и в контрольных лунках при 490 nm перед проведением иммунофлуоресцентного анализа.

Окрашивание молекул клеточной сигнализации и опухолевых клеток. За день до проведения окрашивания разморозьте BME в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи. В день окрашивания поместите систему стеклянных предметных слайдов с восемью камерами на поднос со льдом внутри ламинарного шкафа. Затем с помощью пипетки на 200 µL нанесите по 50 µL ледяного BME в каждую лунку системы стеклянных слайдов.

Убедитесь, что BME распределен равномерно и что в лунках не образовались пузырьки. Инкубируйте покрытые стекла в течение 20 минут. Выберите линию клеток опухоли в состоянии покоя или метастатическую линию.

Соберите клетки с помощью трипсина, как было описано ранее. Затем объедините общее количество клеток, предназначенных для культивирования, в конической пробирке объемом 15 мл. Теперь центрифугируйте клетки и снова осторожно аспирируйте супернатант, оставив небольшое количество среды.

Для получения суспензии одиночных клеток слегка постучите по дну конической пробирки объемом 15 мл. Ресуспендируйте осадок в 400 мкл assay media на каждые 5 × 10³ клеток. Несколько раз аккуратно пипетируйте клетки пипеткой объемом 5 мл, чтобы поддерживать состояние суспензии одиночных клеток; затем внесите по 400 мкл клеточного раствора в каждую из восьми камер, покрытых BME.

Затем инкубируйте систему на предметном стекле, аспирируйте старую среду и заменяйте её свежей assay media каждые четыре дня в соответствующие временные точки эксперимента. Аспирируйте верхний слой среды и добавьте 200 µL фиксатора с добавлением тритона, затем инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. После этого аспирируйте фиксатор с тритоном и добавьте 200 µL чистого фиксатора; инкубируйте при комнатной температуре еще 25 минут.

Снова аспирируйте фиксатор, после чего добавьте в каждую лунку 400 microliters PBS. Инкубируйте планшет еще в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем аспирируйте PBS и добавьте 400 microliters PBS, содержащего 0.05%between 20, и инкубируйте еще 10 минут.

Также при комнатной температуре. Теперь заблокируйте фиксированные клетки, добавив 200 µL блокирующего раствора. После инкубации клеток при комнатной температуре в течение одного часа аспирируйте блокирующий раствор и добавьте в каждую лунку 200 µL первичных антител, разведенных в блокирующем растворе.

Инкубируйте предметные стекла с первичными антителами в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день аспирируйте антитела, затем промойте лунки трижды, добавляя по 400 µL PBS на 15 минут с последующим аспирированием раствора после каждого раза. После аспирирования PBS после последнего промывания добавьте 200 µL вторичных антител, конъюгированных с rod domine red.

Затем накройте систему из восьмикамерных предметных стекол алюминиевой фольгой и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Далее трижды промойте лунки PBS, как и прежде; после третьего промывания закройте стекла средой для заключения Beta Shield с добавлением dpi.

В завершение высушите предметные стекла в течение 40 минут при комнатной температуре в темноте. Здесь представлен пример анализа пролиферации покоящихся клеток опухоли D 2.0 R и метастатических клеток D two A one в 3D-культуре. Клетки D 2.0 R остаются в состоянии покоя на протяжении всего 14-дневного периода культивирования, в то время как высокометастатические клетки D two A one остаются покоящимися только в течение четырех-шести дней культивирования, после чего они начинают пролиферировать в ходе начальной фазы покоя.

Многие клетки остаются одиночными в 3D-культуре, как показано здесь на репрезентативном снимке культуры четвертого дня, в то время как другие неразмножающиеся клетки образуют многоклеточные сфероиды. Переход клеток D2A1 из состояния покоя в пролиферативное состояние в 3D-культуре продемонстрирован здесь на снимке культуры 12-го дня. На данном рисунке видно, что этот процесс сопровождается резкими изменениями морфологии клеток.

Примером агента, препятствующего переходу клеток D two A one из состояния покоя в пролиферативное состояние, является обработка клеток D two A one специфическим ингибитором киназы легких цепей миозина. Клетки D two A one поддерживаются в состоянии покоя, как показано на данном рисунке. Значительное увеличение фосфорилирования легких цепей миозина в клетках D two A one (выделено красным) с последующей реорганизацией филаментов F actin с образованием актиновых стресс-фибров (выделено зеленым) происходит во время их перехода от состояния покоя (дни с 1-го по 4-й) к пролиферации.

Седьмой день. Однако блокирование активности киназы легких цепей миозина в клетках D2A1 с помощью SHRA или препарата ML-7 удерживает клетки D2A1 в состоянии покоя и приводит к ингибированию фосфорилирования легких цепей миозина, полимеризации F-актина и организации стрессовых волокон, как показано здесь. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать модель in vitro для изучения покоя опухоли и перехода к метастатическому росту.