Изоляция по правам островки из не вполне Pancreatectomized Пациенты
July 30th, 2011
Поставка диабетом 2 типа островков для исследований является недостаточным. Здесь мы делимся нашими протоколом для изоляции островков из пациентов, перенесших частичную поджелудочной железы. Этот подход представляет собой уникальное место для получения островков с диабетом 2 типа и клинически соответствует, не больных диабетом в достаточном количестве для фундаментальных и клинических исследований.
Здравствуйте, меня зовут Флориан Аль из отделения хирургии Технического университета в Тритоне. Здравствуйте, меня зовут Грегор Шер, я тоже из отделения хирургии Университетской больницы. В Грейстоне.
Исследования в области биологии и функции век крайне необходимы для углубления нашего понимания физиологии век и патогенеза диабета. К сожалению, человеческие веки у пациентов без диабета и пациентов с диабетом второго типа очень трудно достать. В следующей видеопоследовательности будет показан протокол, как изолировать веки человека от пациентов с частичным оптимизмом поджелудочной железы.
Приобретенные таким образом люверсы могут работать как система in vitro для функционального анализа. Хирургическая резекция ткани поджелудочной железы человека является предпосылкой для выделения глазниц человека. Мы полагаемся на пациентов, перенесших частичную резекцию поджелудочной железы по поводу специфических патологий поджелудочной железы.
В качестве источника ткани поджелудочной железы человека хирург разрезает поджелудочную железу и выполняет частичную резекцию. После этого рыбаков с поджелудочной железой кладут на лед и отвозят в отделение патологии. Патологоанатом определяет количество здоровой на вид и мягкой ткани поджелудочной железы, которую необходимо заработать.
Для изоляции век требуется не менее двух граммов ткани поджелудочной железы. Ткань помещают в раствор укона и перевозят на льду в лабораторию. Первым шагом в изоляции век является измерение веса ткани поджелудочной железы.
Затем образец помещают в 10-сантиметровую чашку. Мы уже подготовили одну колбу объемом 500 миллилитров со 150 миллилитрами среды RPMI и 1 колбу объемом 250 миллилитров с 130 миллилитрами среды RPMI. Затем мы добавляем раствор фермента пищеварения, содержащий один миллилитр ДНК и 20 миллилитров коллагеназы, в 250-миллилитровую колбу и набираем его в 10-миллилитровый шприц.
Очищенная ткань поджелудочной железы затем растягивается путем инъекции среды, содержащей фермент, и измельчается на мелкие кусочки для увеличения площади поверхности и облегчения процесса пищеварения. Этот этап измельчения имеет решающее значение, потому что растяжение только путем инъекции не позволяет правильно распределить фермент в ткани. Параллельно мы собирали контур сбраживания.
Как показано на этом рисунке, направление потока в регистрируемой камере находится внизу и наружу в верхней части камеры. После этого мы приступаем к оставшимся ферментам, содержащим среды, в колбу объемом 500 миллилитров до объема 300 миллилитров, а затем вставляем термометр. Регистрируемая камера содержит металлическую сетку с плохим диаметром 600 микрометров и свободные нитрид силикона диаметром 15 миллиметров каждый.
Переносим ткань поджелудочной железы в камеру, вставляем сетку, закрываем камеру и запускаем насос со скоростью 140 миллилилитров в минуту. Как только температура контура достигает 37 градусов по Цельсию, мы начинаем измерять время пищеварения. Записанная камера встряхивается вручную в соответствии с составом ткани.
Чтобы определить оптимальный временной момент для остановки пищеварения, мы берем периодические пробы, окрашиваем тизон, отделенные глазки красного цвета под микроскопом. Как только проушины оказались отделенными от ткани айно, мы быстро остановили разложение, положив нагревательный змеевик на лед и добавив в контур 200 миллилитров холодного промывочного материала. После этого мы собираем раствор для век, вставляя пробирку с образцом в соколы объемом 250 миллилитров до тех пор, пока контур не опустеет.
Следующая процедура промывки начинается с этапа центрифугирования при 1000 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. На следующем этапе мы выбрасываем раствор для век Snat Resus в средство для мытья и распределяем его в равных долях до 50 миллилитров соколов. Промывка продолжается еще одним этапом центрифугирования со скоростью 1000 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.
В качестве дополнительного шага мы распределяем палитру на дополнительные соколы помимо исходных четырех, в зависимости от размера палитры. Чтобы улучшить промывание, опять же, мы отбрасываем суп и осторожно ослабляем нёбо, чтобы отделить веко от ткани айна. Различная плотность тканей двух частей позволяет наносить градиент кала.
Сначала ресуспендируем гранулу в кале средней плотности 1,1 25 грамм на миллилитр. Гранула должна быть достаточно маленькой, чтобы обеспечить однородную ресуспензию. Далее мы медленно накладываем на это плотности фекальных сред 1,0 81,0 60 и 1,0 37 объемом 10 миллилитров каждая.
После этого мы центрифугируем градиенты со скоростью 2 400 об/мин в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Теперь вы можете различать различные компоненты, разделенные по плотности в дробях. Сначала отбрасываем верхний слой, состоящий из жира и соединительной ткани.
Фракция, которую мы теперь собираем, представляет собой первый слой агрегата век с точками 1,037 и 1,06, который в основном содержит изолированные глазки. Для эффективного выделения важно собирать фракции отдельно. Затем мы собираем фракцию агрегата второго века на границе 1,0 60 и 1,0 80, которая содержит меньше чистых глазков, чем первый слой.
Далее добавляем промывочный материал до общего объема 50 миллилитров для того, чтобы разбавить градиент кала и отправляем в FUT при 1000 об/мин на пять минут. При четырех градусах Цельсия мы выбрасываем средство SUP путем отсасывания, потому что нёбо может быть очень рыхлым из-за холодного пятна. Таким образом, мы должны повторить этап промывания питательной средой для век при 1000 об/мин в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
На последнем этапе мы приостанавливаем культуру человеческих люверсов и люверсов, медиа и культуру. Собранные люверсы помещают в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия от 24 до 48 часов. После этого этапа культивирования веки готовы к дальнейшей обработке.
Этот протокол должен позволить вам изолировать веки человека от ткани поджелудочной железы после частичной панкреатэктомии. Быстрая и холодная транспортировка рыбаков поджелудочной железы в изолятор для век важна для сохранения лучшей жизнеспособности клеток. Изоляционная бригада должна помнить, что процесс пищеварения является очень динамичной процедурой.
Длительность процесса пищеварения сильно зависит от состава тканей. Например, степень фиброза и способность к достаточному введению фермента в ткань поджелудочной железы. Индивидуальная регулировка механической силы в регистрируемой камере и продолжительности процесса сбраживания имеет решающее значение для хорошего выхода век.
Обзор
В этой статье представлен протокол для изоляции островков поджелудочной железы у пациентов, подвергающихся частичной панкреатэктомии, который решает проблему нехватки островков поджелудочной железы 2 типа для исследований. Метод позволяет получать острова из поджелудочной железы как у больных сахарным диабетом 2 типа, так и у недиабетических лиц, способствуя дальнейшим исследованиям в области диабета.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Исследования диабета
- Методы изоляции островков
Фон
- Сахарный диабет 2 типа является растущей проблемой здравоохранения с ограниченными исследовательскими материалами.
- Островки важны для понимания патологии диабета.
- Век от диабетических пациентов трудно получить.
- Частично панкреатэктомия предоставляет уникальную возможность для изоляции островков.
Цель исследования
- Разработать надежный метод изоляции человеческих островков.
- Обеспечить исследования функции островков при диабете.
- Предоставить протокол, который может быть использован в клинических исследованиях.
Используемые методы
- Частично резекция поджелудочной железы для получения ткани.
- Использование ферментных растворов для пищеварения тканей.
- Центрифугирование и методы градиентной плотности для разделения островков.
- Культивирование изолированных островков для дальнейшего анализа.
Основные результаты
- Успешная изоляция островков из поджелудочной железы.
- Протокол позволяет получить достаточное количество островков.
- Изолированные острова жизнеспособны для функциональных исследований.
- Метод может быть адаптирован как для диабетических, так и для недиабетических образцов.
Выводы
- Протокол увеличивает доступность островков для исследований.
- Он поддерживает исследование механизмов диабета и потенциальных лечебных методов.
- Будущие исследования могут строиться на этом методе для получения более глубокого понимания биологии островков.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Reliable access to human islets from both type 2 diabetic and non-diabetic patients is a critical bottleneck for diabetes research and translational target validation. This protocol enables the systematic isolation of viable islets from surgical specimens, supporting mechanistic studies and functional assays in disease-relevant human systems. The approach strengthens predictive confidence in early discovery and bridges a key gap in the diabetes research pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of human islet biology in type 2 diabetes and control tissues.
- Supports functional validation of candidate targets in primary human islets.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing disease-relevant cellular material.
- Improves predictive confidence for downstream portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Provides validated human islets for quantitative in vitro functional assays.
- Enables assay standardization and reproducibility using primary human material.
- Supports development of scalable screening platforms for compound evaluation.
- Improves reliability of functional readouts in early-stage screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease biology through use of patient-derived islets.
- Enables translational biomarker discovery and validation in clinically relevant samples.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing species gap uncertainty.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in diabetes research.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality human islets for functional studies, target validation, and assay development.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification in human islets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound and target evaluation.
- Analytics: Enables measurement of islet yield, purity, and viability for comparative studies.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work with disease-relevant human samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for ongoing diabetes and metabolic disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in diabetes target validation.
- Operational Value: Standardizes islet isolation and culture for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in diabetes portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of diabetes research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pancreatic tissue handling and islet isolation techniques.
- Needs access to specialized instrumentation such as Ricordi chambers and gradient centrifugation systems.
- Demands cross-team standardization for tissue procurement and processing protocols.
- Adaptation may be needed for varying tissue quality and fibrosis levels across patient samples.
- Yield and viability are influenced by tissue composition and transport logistics.
