Введение в Ультразвуковое Целевые микропузырьков Техника Уничтожение

UTMD означает ультразвуковую направленную деструкцию микропузырьков. UTMD может использоваться для адресной доставки биоактивных молекул, включая терапевтические гены, в органы-мишени, доступные для ультразвукового воздействия, такие как сердце и печень. При UTMD биоактивные молекулы, такие как отрицательно заряженные плазмидные ДНК-векторы, кодирующие интересующий ген, присоединяются к катионным оболочкам липидных микропузырьковых контрастных веществ; микропузырьки с привязанным вектором можно вводить внутривенно или непосредственно в левый желудочек сердца.

У более крупных животных доставку также можно осуществлять с помощью интракоронарного катетера с периодом выдержки или без него. Последующий перенос из кровотока в целевой орган происходит оптимально за счет акустической кавитации на резонансной частоте микропузырьков. Вероятно, механическая энергия, возникающая при разрушении микропузырьков, приводит к образованию временных пор в эндотелиальных клетках или между ними в микроциркуляторном русле целевой области.

В результате этого эффекта сонопорации эффективность трансфекции в эндотелиальные клетки и через них повышается, что позволяет депонировать векторы, кодирующие трансген, в окружающие исследуемые ткани. Плазмидная ДНК, остающаяся в кровотоке, быстро расщепляется нуклеазами в препарате микропузырьков крови. Аликвота приготовленного стокового раствора микропузырьков, содержащего глюкозо-фосфатно-солевой буфер, диолеглицерин-3-фосфатидилхолин и диолеглицерин-3.

Фосфатидилэтаноламин сначала инкубируют при 40 °C в течение 15 минут. Затем подогретый раствор микропузырьков переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл, содержащую глицерин и от 1 до 2 мг очищенной плазмидной ДНК, кодирующей экспрессионную конструкцию интересующего гена. Добавляют фосфатно-солевой буфер до конечного объема 500 µL.

Затем воздух в микропробирке заменяют октафторпропаном. После этого микропробирку интенсивно встряхивают в стоматологическом амальгаматоре в течение 20 секунд. Калибровка оборудования перед первым использованием: необходимо откалибровать ультразвуковой преобразователь кавитации UTMD с частотой 1 МГц для обеспечения надлежащего механического индекса и частоты повторения импульсов.

Погружной преобразователь с частотой 1 MHz подключен к генератору сигналов через усилитель мощности. Преобразователь помещен в пластиковый контейнер, наполненный водой, и направлен непосредственно на гидрофон, который подключен к осциллографу через усилитель заряда; частота сигнала, амплитуда, длительность пачки и коэффициент усиления мощности могут быть изменены для получения рабочего цикла и механического индекса, оптимальных для кавитации микропузырьков. В данной установке система была откалибрована на механический индекс, эквивалентный приблизительно 1,3 при подаче микропузырьков на частоте 1 MHz и UTMD перед подачей микропузырьков и U-T-M-D-C 57 BL. Шести мышам вводят кетамин в дозе 100 mg/kg и ксилазин в дозе 5 mg/kg путем внутрибрюшинной (IP) инъекции для наркоза.

Доставку микропузырьков осуществляют внутривенно путем прямого введения в левый желудочек сердца или через катетеризацию хвостовой вены; способ прямого введения в сердце будет продемонстрирован далее. Раствор микропузырьков с нагрузкой в виде плазмидной ДНК в объеме до 100 µL вводят в левый желудочек сердца через иглу 30-го калибра, введенную в четвертом межреберье спереди под ультразвуковым контролем. Болюс раствора микропузырьков в результате инъекции в левый желудочек визуализируют с помощью высокочастотного ультразвукового датчика VisualSonics, установленного стационарно на грудной клетке мыши в режиме сканирования по длинной оси.

Сразу после инъекции в течение примерно пяти минут проводится разрушение микропузырьков с помощью второго, меньшего по размеру низкочастотного преобразователя с частотой 1,0 МГц, который удерживается непосредственно над целевым органом для локального воздействия на эту область. Ультразвук подается на печень с частотой повторения импульсов 1,0 МГц при механическом индексе примерно от 1,3 до 1,5 и периодом повторения импульсов 100 мс на каждые 20 циклов; alternatively, подача импульсов может быть синхронизирована с ЭКГ мыши в виде серии из трех ультразвуковых кадров каждые четыре–шесть сердечных циклов. При методе доставки микропузырьков через хвостовую вену мышь анестезируют таким же образом, как и при введении шприца с плазмидой.

Микропузырьки, конъюгированные с ДНК, вводят через катетер в хвостовую вену с иглой 27G. Катетер вводится в дистальную треть правой или левой латеральной вены, проходящей вдоль хвоста мыши. Шприц с микропузырьками помещают в инфузионный насос, который автоматически вводит заданный объем раствора с постоянной скоростью в течение определенного времени.

Биолюминесцентный анализ UTMD: эффективность доставки плазмидной ДНК с помощью UTMD может быть оценена различными методами в зависимости от генов, закодированных в конструкции. В частности, биолюминесцентная визуализация in vivo является одним из методов, позволяющих контролировать наличие и продолжительность экспрессии генов у мышей, трансфицированных плазмидой, кодирующей репортерный ген биолюминесценции, такой как люцифераза.

Система визуализации in vivo Enogen используется для биолюминесценции. Снимки обычно делают всех мышей на первый день после трансфекции, опосредованной UTMD, и повторяют каждые три-четыре дня до тех пор, пока экспрессия биолюминесцентного гена перестает визуально определяться системой. Для подготовки мышей к биолюминесцентной визуализации сначала вводят им внутрибрюшинно репортерный люциферазный зонд Lucifer.

Затем мышам вводят анестетик. Примерно через три минуты дают пройти биораспределение субстрата люциферазы в течение около 10 минут, после чего животное или животных помещают в камеру визуализации Xeno Gen и проводят сканирование всего тела; в процессе сбора данных система определяет количество фотонов, излучаемых в результате фотохимической реакции люциферазы с люциферином после получения каждого изображения.

С помощью системы визуализации in vivo Xeno и соответствующего программного обеспечения измеряют и количественно определяют видимую люминесцентную область интереса.