Ориентация обонятельных нейронов лампы с использованием комбинированных В Vivo Электропорация и Gal4 основе Enhancer Ловушка данио рерио Линии
15 августа 2011 г.
Временным и пространственным разрешением генетических манипуляций определяет спектр биологических явлений, что они могут нарушать. Здесь мы используем во времени и пространстве дискретных В естественных условиях Электропорации, в сочетании с трансгенными линиями данио, чтобы вызвать экспрессию GFP трансгенов в частности, в нейронах развивающихся обонятельной луковице.
В данном методе показано, как сочетание пространственно и временно дискретной электропорации in vivo с использованием трансгенных линий zebrafish позволяет селективно воздействовать на определенные области развивающегося эмбриона для экспрессии трансгена. Начните с четырех трансгенных рыб линии cal TA, полученных методом ловушки энхансеров для ограничения экспрессии генов в интересующих типах клеток. В данном случае объектом является развивающаяся обонятельная луковица на определенном этапе развития; введите плазмиду-репортер GFP в передний отдел переднего мозга in vivo и проведите электропорацию для облегчения доставки ДНК. Результаты, полученные с помощью флуоресцентной визуализации in vivo, указывают на точную локализацию трансгена в определенное время и в конкретном процессе развития.
Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как инъекция плазмиды на стадии одной клетки, заключается в том, что экспрессия направлена на конкретные типы клеток в определенной области развивающегося мозга. Используйте трансгенную линию zebrafish, созданную методом опосредованной ловушки энхансеров, для обеспечения экспрессии как фактора транскрипции calt A four, так и репортерного белка M cherry в специфических областях развивающегося мозга. Проведите скрещивание взрослых рыб, гетерозиготных по трансгенной вставке, с рыбами дикого типа, чтобы получить примерно 50% трансгенного потомства.
Теперь обработайте трансгенные эмбрионы 100 мкМ phenyl threa, начиная с шести-восьми часов после оплодотворения, чтобы заблокировать образование пигмента и облегчить флуоресцентную визуализацию. Через 24–28 часов после оплодотворения перенесите эмбрионы в яичную воду без PTU и под флуоресцентным микроскопом идентифицируйте трансгенные эмбрионы по экспрессии M cherry в microwave. Приготовьте 0,5% раствор низкоплавкого aros в буфере для электропорации с добавлением trica, а затем доведите раствор до равновесного состояния.
В инкубатор, разогретый до 34–37 °C, поместите чашку Петри диаметром 60 мм, в центр которой нанесите большую каплю (примерно 500 µl) раствора agro. С помощью тонкого пинцета удалите хорион с трансгенных эмбрионов. Перенесите освобожденные эмбрионы в чашку Петри с буфером для электропорации и 0,02% анестетика tricaine на две минуты.
Теперь перенесите от шести до восьми анестезированных эмбрионов в подготовленную каплю aros, используя обрезанные наконечники пипеток Майкла. Расположите эмбрионы так, чтобы они были ориентированы в одном направлении и выстроены в вертикальный ряд. Зафиксируйте эмбрионы в этом положении, затвердев aros с помощью большой чашки Петри, содержащей два-три миллиметра льда.
Залейте чашку буфером для электропорации с добавлением trica, убедившись, что раствор полностью покрывает затвердевшую каплю aros. Подготовьте очищенную экспрессионную плазмиду GFP с красителем феноловым красным для инъекции. Теперь изготовьте пипетки для микроинъекций, используя наконечник микрозагрузочной пипетки.
Добавьте от 1 до 2 µL раствора плазмидной ДНК в инъекционную пипетку, затем установите и зафиксируйте заполненную пипетку в держателе для пипеток системы нагнетательной инъекции. Удалите излишки раствора из кончика пипетки, резко погрузив её в смоченную салфетку Kim wipe, пока импульсы давления не обеспечат выход красного раствора ДНК, при этом пипетка должна быть направлена к переднему концу развивающегося мозга. Введите раствор плазмидной ДНК в желудочки развивающегося мозга с помощью нагнетательной инъекции.
Доставьте ДНК в область, прилегающую к будущей обонятельной луковице. Вводите ДНК до тех пор, пока красный краситель не станет отчетливо виден на переднем конце желудочка переднего мозга. Немедленно переходите к этапу электропорации, чтобы предотвратить диффузию и разбавление ДНК.
Настройте стимулятор SD nine на подачу одиночных электропорационных импульсов длительностью 5 ms при напряжении 70 V. Расположите электроды таким образом, чтобы положительный электрод находился рядом с внутренним концом эмбриона, а отрицательный электрод — позади головы эмбриона.
Вручную подайте восемь импульсов электропорации, используя один переключатель стимулятора SD nine. Интервал между импульсами должен составлять одну секунду. Оставьте эмбрионы для восстановления минимум на 10 минут.
Теперь с помощью тонкого пинцета осторожно обведите контуры эмбрионов, избегая непосредственного контакта с ними. Затем извлеките эмбрионы из агарозы. Перенесите эмбрионы в яйцевую воду и храните при температуре 28 °C до проведения анализа экспрессии GFP.
Перенесите эмбрионы в яичную воду с добавлением 0,02% анестетика trica на несколько минут, как и прежде, но в центр чашки Петри меньшего размера (35 мм). Добавьте большую каплю 0,5% раствора низкоплавкого agarose в яичной воде с trica. Теперь с помощью обрезанных наконечников микродозатора перенесите один анестезированный эмбрион в эту каплю agarose.
Расположите эмбрион вертикально, чтобы обеспечить дорсальный обзор развивающегося мозга под вертикальным микроскопом. Затвердейте арос на льду и используйте обрезанные наконечники микродозатора для фиксации ориентации эмбриона. В завершение залейте чашку яичной водой с добавлением trica, убедившись, что раствор полностью покрывает застывшую каплю ароса.
В данном примере временное разрешение электропорации in vivo сочетается с экспрессией, специфичной для определенного типа клеток и опосредованной трансгенными линиями с ловушкой энхансеров, для воздействия на развивающуюся обонятельную луковицу. Трансгенная линия с ловушкой энхансеров демонстрирует конститутивную экспрессию m cherry и calt A four в заднем мозге, cerebellum, four brainin и обонятельной луковице у эмбрионов на пятый день после оплодотворения. Важно отметить, что через четыре дня после электропорации клетки, экспрессирующие GFP, демонстрируют типичные аксональные проекции митральных клеток обонятельной луковицы.
Данное сравнение сигналов от M Cherry и GFP при меньшей экспозиции демонстрирует, что тела клеток, экспрессирующих GFP, действительно локализованы в обонятельной луковице при использовании конструктов с короткошпилечными РНК. Эту процедуру также можно использовать для индуцирования потери функции в специфических типах клеток развивающегося мозга.
Обзор
В данном исследовании представлен метод направленной экспрессии генов в развивающемся обонятельном луковице zebrafish с использованием электропорации in vivo. Комбинируя эту технику с трансгенными линиями, исследователи могут добиться точного пространственного и временного контроля экспрессии генов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генетическая манипуляция
- Биология развития
Теоретические сведения
- Электропорация in vivo позволяет осуществлять направленную доставку ДНК в определенные области развивающихся эмбрионов.
- Трансгенные линии данио-рерио позволяют ограничить экспрессию генов определенными типами клеток.
- Обонятельная луковица является критически важной областью для изучения развития нейронов.
- Временное и пространственное разрешение при генетических манипуляциях имеет важное значение для понимания процессов развития.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод индукции экспрессии генов в специфических нейронах луковицы обоняния рыбки зебрафиш.
- Сравнить эффективность данного метода с традиционными методами инъекции плазмид.
- Изучить возможность проведения исследований по потере функции с использованием конструктов коротких шпилечных РНК.
Используемые методы
- Использование трансгенных линий данио-рерио, полученных методом ловушек энхансеров.
- Инъекция плазмиды-репортера GFP в передний мозг с последующей электропорацией.
- Флуоресцентная визуализация для подтверждения локализации экспрессии трансгена.
- Параметры электропорации, установленные для достижения оптимальной доставки ДНК.
Основные результаты
- Успешный таргетинг экспрессии GFP в обонятельную луковицу на определенных стадиях развития.
- Продемонстрированы аксональные проекции митральных клеток обонятельной луковицы, экспрессирующих GFP.
- Сравнение сигналов M Cherry и GFP подтвердило локализацию экспрессии трансгена.
- Установлена возможность индуцирования потери функции в конкретных типах клеток.
Выводы
- Данный метод является мощным инструментом для изучения функций генов в конкретных популяциях нейронов.
- Он обладает преимуществами перед традиционными методами, позволяя осуществлять направленную экспрессию в определенных областях.
- Этот подход может углубить наше понимание процессов развития головного мозга.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод обеспечивает точный пространственный и временной контроль экспрессии трансгена в определенных популяциях нейронов, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах нейробиологических исследований. Благодаря сочетанию электропорации in vivo с линиями ловушек энхансеров данный подход представляет собой воспроизводимую систему для изучения функций генов в нейронных цепях, имеющих значение при патологиях. Этот метод повышает достоверность прогнозов при выборе мишеней за счет снижения побочных эффектов и возможности проведения исследований с потерей функции в конкретных типах клеток.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы в определенных популяциях нейронов обонятельной луковицы.
- Практическая ценность: Обеспечивает пространственно ограниченную экспрессию трансгена для выяснения функции гена в конкретных типах клеток.
- Прогностическая ценность: Способствует снижению биологических рисков путем установления связи между модуляцией мишени и аксональным фенотипом митральных клеток.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные флуоресценции для оценки индукции трансгена и паттернов аксональных проекций.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированную подготовку электропорированных эмбрионов для получения воспроизводимых изображений и проведения анализа.
- Масштабируемость: поддерживает мультиплексное тестирование реагентов посредством совместной электропорации конструкций RNAi или CRISPR на трансгенных фонах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Мишенью являются нейроны обонятельной луковицы — системы, имеющей значение для моделей нейроонтогенетических и нейродегенеративных расстройств.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от валидации мишени на стадии открытия к фенотипическому скринингу в доклинических моделях на zebrafish.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет проводить анализ потери функции с помощью shRNA для оценки необходимости мишени в формировании нейронных цепей.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, позволяя проверять гипотезы о мишенях до этапа идентификации соединений-лидеров и обеспечивая готовность анализа для фенотипического скрининга на моделях позвоночных.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез о функциях генов в конкретных популяциях нейронов посредством пространственно и временно контролируемой экспрессии трансгенов.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных, количественно измеряемых сигналов флуоресценции, что позволяет воспроизводимо оценивать воздействие соединений или генетических модификаций.
- Аналитика: позволяет сравнивать паттерны аксональных проекций и локализацию клеток в качестве количественных показателей взаимодействия с мишенью.
- Трансляционные исследования: связывают раннюю валидацию мишеней с фенотипическим анализом на моделях неврологических заболеваний у zebrafish.
- Повторное использование в масштабах предприятия: создает универсальную платформу для воздействия на несколько областей мозга с использованием различных линий ловушек энхансеров и координат электропорации.
Операционный и корпоративный эффект
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов при валидации мишеней благодаря экспрессии трансгенов в конкретных типах клеток и анализу фенотипических показателей.
- Практическая ценность: Стандартизация подготовки эмбрионов, параметров электропорации и протоколов визуализации для разных лабораторий.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности в нейрональных путях мишеней.
- Влияние на портфель: Обеспечение приоритизации мишеней с учетом рисков на основе функциональной валидации в соответствующих заболеванию нейронных цепях.
Особенности реализации
- Опыт в области эмбриологии zebrafish, методов микроинъекций и электропорации.
- Доступ к флуоресцентной микроскопии и трансгенным линиям с ловушками энхансеров с определенными паттернами экспрессии.
- Стандартизация дизайна ДНК-конструктов и условий буфера для электропорации для обеспечения воспроизводимости.
- Рекомендации по адаптации метода для воздействия на другие области мозга с использованием альтернативных линий с ловушками энхансеров.
- Ограничения включают вариабельность эффективности электропорации и необходимость оптимизации концентрации ДНК и параметров импульса.
