Исследование космического подвижности ее клеток волос с Сочетание внешнего переменного электрического поля и стимулирование Высокоскоростной анализ изображений
18 июля 2011 г.
Надежный метод для исследования внешней волосковых клеток (OHC) подвижных ответов, в том числе electromotility, медленный моторики и изгиб, описывается. OHC подвижность, вызванные стимуляцией с внешнего переменного электрического поля, и метод использует преимущества высокоскоростной записи изображения, светодиодной подсветки, а в прошлом поколении анализа изображений программное обеспечение.
Общая цель данной процедуры — представить надежный метод исследования двигательных реакций наружных волосковых клеток (НВК), включая электромотильность, медленную мотильность и изгиб на акустических частотах. Для этого сначала извлекают височные кости морских свинок, мышей или других млекопитающих и вскрывают барабанную полость для обнажения улитки. На втором этапе улитку погружают в среду Lebovits L 15, удаляют апикальную область костной раковины, спиральную связку, стриаду ваза и удаляют кортиев орган.
После пятиминутной инкубации кортиева органа в коллагеназе в концентрации 1 mg/mL его переносят в регистрирующую камеру с помощью шприца Гамильтона объемом 50 µL, после чего клетки диссоциируют путем их прогонки через иглу. Затем регистрирующую камеру перемещают под микроскоп для стимуляции клеток внешним переменным электрическим полем и видеорегистрации двигательных реакций изолированных наружных волосковых клеток с помощью высокоскоростной камеры. В конечном итоге с помощью компьютерного анализа изображений можно оценить электромотильность наружных волосковых клеток, медленную мотильность и изгиб на акустических частотах.
Начните выполнение данной процедуры с извлечения височных костей у морских свинок, мышей или других моделей млекопитающих. Затем вскройте височные кости с помощью кусачек. Чтобы обнажить улитку, осторожно удалите излишки костной ткани, стараясь сохранить целостность костной капсулы улитки, и погрузите её в среду L 15.
Под микроскопом вскройте апикальную область улитки. Удалите за dry-реактив, VASIs и спиральную связку с помощью кончика лезвия скальпеля, микроиглы или тонкого пинцета. Удалите кортиев орган из модеуса улитки с помощью пинцета.
Затем поместите улитку в раствор коллагеназы в концентрации 1 mg/mL при комнатной температуре на пять минут. Если требуются волосовидные клетки из базальных завитков улитки, удалите костную оболочку, покрывающую основание улитки, с помощью зонда и отделите спиральный орган от височной кости лезвием скальпеля. Перед извлечением органа Корти перенесите орган Корти в записывающую камеру с помощью шприца Гамильтона объемом 50 µL. Затем диссоциируйте клетки, пропуская их несколько раз через иглу.
На данной схеме представлен генератор внешнего переменного электрического поля и его связи с системой захвата изображений, цепями управления и программным обеспечением, специально разработанным в инженерном центре Института Хауса (House Ear Institute). Экспериментальная установка, использованная в данном опыте, состоит из инвертированного микроскопа Axia vert 1 3 5 TV с альтернативной системой освещения на базе светодиодов и двух электронных микроманипуляторов. На микроскопе установлены три камеры: управляемый ПК сверхвысокоскоростной фототрон, камера fast cam X 10 24 PCI в телепорте, которая обладает высоким разрешением и позволяет захватывать изображения на высоких частотах до 100 000 FPS.
Изображения, передаваемые высокоскоростной камерой, наблюдаются непосредственно на мониторе ПК. Дополнительная обычная CCD-камера в окулярном порту подключена к монитору высокого разрешения. Обычный цифровой фотоаппарат в переднем порту позволяет делать статичные снимки; специализированное программное обеспечение, запущенное на том же ПК, управляет спуском высокоскоростной камеры, системой освещения и внешней установкой переменного электрического поля.
Два электрода, состоящие из двух серебряных проволок диаметром 0,25 миллиметра с расстоянием между кончиками 0,8 миллиметра, закреплены на электрическом микроманипуляторе. Затем с помощью внешнего электрода откалибруйте электрическое поле. Этот электрод измеряет электрический потенциал в различных точках, создавая карту электрического поля.
Если одну изолированную наружную волосковую клетку поместить между концами электродов так, чтобы ее продольная ось была параллельна приложенному переменному электрическому полю, она будет удлиняться и укорачиваться с той же частотой, что и электрическое поле. Например, здесь показана клетка, стимулируемая на частоте 50 hertz, при записи со скоростью 1000 кадров в секунду. На следующем изображении показана клетка, стимулируемая на частоте четыре kilohertz, при записи со скоростью 18 000 кадров в секунду.
Если клетку расположить перпендикулярно полю, можно наблюдать и исследовать другой тип изгиба внешних волосковых клеток. Эта клетка, например, изгибается при стимуляции электрическим полем с частотой 50 hertz, направленным перпендикулярно ее длинной оси. Внешние волосковые клетки могут изменять форму в ответ на неэлектрическую стимуляцию.
Такая реакция называется сниженной моторикой, которую также можно исследовать с помощью данного метода. Выберите различные варианты стимуляции из четырех доступных протоколов. Первый из них — непрерывная одночастотная стимуляция.
Обратите внимание, что с помощью разработанного собственного программного обеспечения можно выбрать режим стимуляции, частоту, амплитуду и тип волны, которые отмечены красными кругами. Второй протокол стимуляции представляет собой пачечную стимуляцию на одной частоте, при которой регулируются длительность пачек и интервалы между ними. Третьим вариантом является линейное сканирование, при котором настраиваются начальная и конечная частоты.
Четвертый протокол стимуляции — мультистимуляция, которая позволяет комбинировать различные режимы стимулов. После выбора соответствующих параметров управляющее программное обеспечение настраивает систему, позволяя оператору запустить синхронизированную с освещением видеозапись и стимуляцию клеток одним нажатием кнопки на экране компьютера. В данном видео изолированные наружные волосковые клетки демонстрируют изменения длины или кривизны при воздействии внешнего переменного электрического поля, направленного соответственно параллельно или перпендикулярно их продольной оси.
Ответы наружных волосковых клеток анализируются в автономном режиме с помощью функции отслеживания признаков в программном обеспечении Pro Analysts; здесь показана наружная волосковая клетка, стимулируемая с частотой 50 Гц, при записи со скоростью 1000 кадров в секунду. Программное обеспечение предоставляет расстояние между двумя точками покадрово, как показано здесь в процессе сокращения клетки. Расстояние между точками, выбранными на верхушке (отмечена красным как кутикулярная пластинка) и основании клетки (отмечено зеленым как базальный полюс), меньше, и оно увеличивается при удлинении клетки; программное обеспечение выполняет покадровый анализ изменений длины наружной волосковой клетки.
Панель в нижней части изображения показывает траекторию движения. В данном примере общая величина изменения длины составляет около 6,5 пикселей. Здесь представлен пример, демонстрирующий, что край клетки может быть обнаружен, а площадь оптического среза может быть автоматически измерена с помощью функции отслеживания контуров в программном обеспечении pro analys.
В данном эксперименте полистироловые микросферы случайным образом добавляются в раствор ванночки и прочно прикрепляются к плазматической мембране. Можно одновременно выбрать несколько разных микросфер, и программное обеспечение сможет автоматически отслеживать их все кадр за кадром. Таким образом, клетки можно разделить на сектора, а подвижность каждого сектора оценивать независимо.
Выбирая микросферы, расположенные на боковых краях клетки, можно независимо оценивать изменения длины каждого сегмента, а также изменения угла одного сегмента относительно другого. После освоения эта техника может быть выполнена за три часа при условии правильного проведения процедуры.
Разумеется, для офлайн-анализа записанных видеороликов потребуется дополнительное время. Однако при наличии подходящего программного обеспечения этот анализ может быть завершен примерно за три дополнительных часа на один ролик. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое понимание того, как исследовать двигательные реакции наружных волосковых клеток, включая электромотильность, медленную мотильность и изгиб на акустических частотах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается надежный метод исследования мотильных реакций наружных волосковых клеток (НВК), включая электромотильность, медленную мотильность и изгиб. Метод основан на использовании внешнего переменного электрического поля для стимуляции НВК в сочетании с высокоскоростной съемкой и современным программным обеспечением для анализа изображений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Электрофизиология
Теоретические основы
- Наружные волосковые клетки играют ключевую роль в слуховом восприятии.
- Понимание мотильности НВК необходимо для изучения функций улитки.
- Предыдущие методы не обладали достаточной надежностью при измерении двигательных реакций.
- Целью данной работы является совершенствование методов исследования поведения НВК.
Цель исследования
- Представить надежный метод изучения подвижности наружных волосковых клеток (НВК).
- Оценить ответы НВК на электрическую стимуляцию.
- Углубить понимание механики улитки.
Используемые методы
- Выделение височных костей из моделей млекопитающих.
- Изоляция улитки и кортиева органа.
- Использование коллагеназы для диссоциации клеток.
- Стимуляция клеток внешним электрическим полем и запись ответов.
Основные результаты
- Успешная стимуляция наружных волосковых клеток (НВК) с измеряемыми двигательными ответами.
- Высокоскоростная визуализация позволила зафиксировать детальные особенности моторики.
- Компьютерный анализ обеспечил получение количественных данных об ответах НВК.
- Получены новые сведения о механизмах электромотильности НВК.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к изучению подвижности наружных волосковых клеток (OHC).
- Полученные результаты способствуют пониманию функций улитки.
- Будущие исследования могут опираться на данную методологию для получения дополнительных данных.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание подвижности наружных волосковых клеток дает представление о механизмах кохлеарного усиления — процессе, имеющем критическое значение для обработки слуховых сигналов. Данный метод позволяет проводить количественный анализ электромоторности и медленной подвижности на акустических частотах, что способствует валидации мишеней в исследованиях слуха. Описываемый подход представляет собой воспроизводимую платформу для оценки клеточного ответа на электрическую стимуляцию, помогая в проверке механистических гипотез, связанных с сенсорной трансдукцией.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функции моторных белков во внешних волосками клеток посредством контролируемой стимуляции электрическим полем.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированную систему для изоляции и стимуляции внешних волокнообразных клеток млекопитающих с целью оценки фенотипов подвижности.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: облегчает подготовку валидированных систем наружных волосковых клеток для последующей оценки двигательных реакций на стимулы.
- Практическая ценность: способствует стандартизации анализа за счет использования высокоскоростной съемки и автоматизированного отслеживания контуров для количественного измерения длины и кривизны.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает этап открытия и доклинические исследования, позволяя анализировать ответы наружных волосковых клеток, имеющих значение для функции кохлеарного усилителя.
- Практическая ценность: Позволяет проводить оценку клеточной подвижности с учетом рисков при определенных протоколах стимуляции, что помогает принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) при валидации мишени.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы биологических исследований, позволяя проверять гипотезы о механизмах подвижности наружных волосковых клеток с помощью контролируемой стимуляции и визуализации высокого разрешения.
- Открывательная биология: способствует уточнению сигнальных путей и снижению биологических рисков за счет количественной оценки электромотильности и реакций изгиба на электрическую стимуляцию.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимой изоляции клеток и стимуляции с измеримыми результатами на частотах до 10 kHz.
- Аналитика: генерирует количественные данные об изменении длины и кривизны клеток, что позволяет проводить сравнение при различных условиях стимуляции.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, предоставляя данные о двигательных реакциях, лежащих в основе функции улитки.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования метода для изучения реакций сенсорных клеток на различных моделях млекопитающих и парадигмах стимуляции.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения неопределенности в механизмах механотрансдукции.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов подготовки клеток, стимуляции и анализа изображений.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), предоставляя количественные данные о клеточных реакциях, связанных со слуховой функцией.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе валидированных фенотипов подвижности в системах, релевантных для изучаемого заболевания.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области микрохирургии для извлечения височной кости и выделения кортиева органа.
- Зависит от систем высокоскоростной съемки и специализированного программного обеспечения для отслеживания движения и анализа контуров.
- Необходима межгрупповая стандартизация для обеспечения единообразия подготовки клеток и параметров стимуляции.
- Требуется учет особенностей адаптации при применении метода для других видов животных или типов клеток.
- Ограничено необходимостью наличия жизнеспособных изолированных наружных волосятых клеток, что ограничивает пропускную способность и возможности длительного хранения.
