Прочная Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих эмбриональных стволовых клеток населения

Общая цель данного эксперимента заключается в получении однородных уровней гепатоцитов человека для изучения биологии печени человека in vitro. Это происходит путем введения человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих ЭСК в дефинитивную энтодерму с использованием физиологических стимулов, активных в А и WINT, три A.As второго этапа дефинитивная энтодерма с высокой эффективностью прогоняется в эндодерму печени. Затем эндодерма печени, полученная из ЭСК человека, созревает in vitro для производства функциональных гепатоцитов человека.

Результаты ПЦР вестерн-блоттинга, иммунофлуоресценции, синдрома Элизы и метаболизма лекарств указывают на то, что этот метод получает гепатоциты из человеческих ЭСК с эффективностью около 90%. С помощью этого метода мы, теоретически, можем генерировать неисчерпаемые запасы первичных гепатоцитов человека, которые демонстрируют заметный уровень функции печени человека. В будущем это будет способствовать точному прогнозированию токсичности лекарств и обеспечит поддержку печени человека. Хитрость заключается в том, чтобы стимулировать солнечную дифференцировку и плотность ядра клеток человека.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку плотность ядра клеток имеет важное значение для создания однородной клеточной популяции. Мы обучили более 15 человек в четырех центрах по всему миру для успешного выполнения этой техники. Начинают с культивирования эмбриональных стволовых клеток человека и размножают на покрытых матригелем планшетах с эмбриональными фибробластами мыши в кондиционированной среде ORM cm с добавлением основного FGF.

Важно тщательно охарактеризовать ЭСК человека, сохраненные до печеночной дифференцировки. Например, эти клетки демонстрируют человеческую морфологию ЭСК. Они также экспрессируют плюрипотентные маркеры стволовых клеток, OCT 4 и нано, в уровнях, сравнимых с положительным контролем линии ESC человека H 7.

Кроме того, ЭСК человека положительны на СС EEA 4. Когда ЭСК человека достигают бегучести от 30 до 60% со, замените МЭ КМ свежеприготовленной средой для дифференцировки. Чтобы инициировать печеночную дифференцировку, среду следует заменять каждые 24 часа в течение трех дней.

Через три дня клетки приобретают треугольный вид, поскольку они начинают дифференцироваться в сторону эндодермального фенотипа. Переключите среду на дифференциацию SR DMSO. Среднерослое выращивание в течение четырех-пяти дней.

Замена носителя каждые 48 часов. По прошествии этого пятидневного периода клетки начнут приобретать многоугольный вид, характерный для печеночных клеток. Дифференцировка ЭСК человека в эндодерму печени отражается в ряде глубоких морфологических изменений к девятому дню.

Более того, экспрессия Octa 4 в течение девяти дней постепенно уменьшается. Напротив, печеночные транскрипторы ФП и альбумина увеличиваются с седьмого дня и далее. Продолжайте созревание клеток и поддержание фенотипа печени в конечной среде в течение девяти дней со свежей средой каждые 48 часов.

Наконец, наблюдайте за культивируемыми клетками с помощью фазово-контрастной микроскопии на предмет постепенных морфологических изменений от остроконечной треугольной формы до характерной морфологии печени, демонстрирующей полигональный вид, для количественной оценки функции эндодермы печени. Для цитохрома Р четыре 50 ферментативная активность, в частности СИП три А четыре или СИП один А два. Первый день инкубации 17.

Клетки эндодермы печени, полученные из ЭСК человека, со специфическим субстратом осуществляют реакции в трех экземплярах. Не забывайте использовать питательные среды для тканевых культур в качестве отрицательного контроля: инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти часов. Соберите надосадочную жидкость и измерьте относительные уровни базальной ферментативной активности, как указано в инструкции производителя.

Теперь для каждого образца рассчитайте ферментативную активность на миллиграмм белка, определенную по A-B-C-A-S. Проведено иммуноокрашивание типичных культур, полученных данным методом in vitro созревания печеночной энтодермы. Продемонстрировать гомогенную экспрессию трех маркеров печени человека, альбумина A FP и ein.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как эффективно дифференцировать стволовые клетки человека и обучающиеся к гепатоцитам. После освоения этой техники ее можно выполнять ежедневно, уделяя около двух с половиной минут на миллион клеток. Очень важно ежедневно проверять морфологические изменения в процессе дифференцировки.