Проксимальная культуральная система: метод культивирования in vitro для изучения паракринной передачи сигналов между клетками

При паракринной передаче сигналов клетки производят и выделяют сигнальные молекулы, которые вызывают реакцию в соседних клетках. Чтобы имитировать паракринную сигнализацию, начните с приготовления суспензий одиночных клеток раковых клеток яичников и мезотелиальных клеток в соответствующей среде.

Далее возьмите инвертированную пористую пленчатую вставку в стерильную чашку для посева. Пипетируйте суспензию раковых клеток на нижнюю поверхность мембраны вставки, чтобы сформировать жидкий купол. Инкубируйте, чтобы позволить клеткам успокоиться и прикрепиться к мембране.

Переверните вкладыш, чтобы слить жидкость. Перенесите вкладыш в чашку для свежей культуры, содержащую питательную среду для питания раковых клеток, прилипших к нижней поверхности мембраны. Теперь добавьте суспензию мезотелиальных клеток в колодец для вставки. Инкубируйте клетки, чтобы позволить им прилипнуть к противоположной стороне мембраны, отрицая любой прямой контакт между двумя типами клеток.

Во время культивирования оба типа клеток секретируют сигнальные факторы. Эти молекулы диффундируют через пористую мембрану по направлению к соседним клеткам. Они связываются со специфическими клеточными рецепторами и индуцируют сложные сигнальные каскады в обоих типах клеток.

Начните с отделения раковых клеток яичников от 80% сливающейся смеси с 1 миллилитром 0,25% трипсина на 40-60 секунд, после чего следует нейтрализация реакции 6 миллилитрами полной питательной среды. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах свежей полной питательной среды.

После подсчета разбавьте клетки до 100 000 клеток рака яичников на миллилитр полной концентрации питательной среды и поместите три инвертированных 0,4-микрометровых вкладыша из поликарбонатных мембранных клеточных культур, обработанных культурой тканей, в зависимости от размера в тестовую чашку для стерильной культуры тканей. Промаркируйте вкладыши в соответствии с условиями эксперимента и аккуратно нанесите раковые клетки на дно каждого вкладыша концентрическими кругами, начиная с середины мембраны и двигаясь наружу, чтобы образовался купол объемом 800 микролитров.

Будьте предельно осторожны при посеве клеток на нижнюю поверхность вкладыша, чтобы купол клеток, содержащих среду, не сбегал с краев вкладыша во время инкубации.

Когда все вкладыши будут засеяны, накройте чашку крышкой и осторожно поместите вкладыши в инкубатор для клеточных культур. Примерно через 4 часа отделите ГПМЦ с 2 миллилитрами 0,25% трипсина на одну-две минуты с последующей нейтрализацией реакции 12 миллилитрами полной питательной среды.

Соберите ГПМЦ центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах полной питательной среды для подсчета. Разбавьте клетки до 300 000 HPMC на миллилитр полной питательной среды и добавьте 2,5 миллилитра свежей полной питательной среды в каждую лунку 6-луночной культуральной тарелки.

Используя стерильные щипцы, поместите каждую вставку правой стороной вверх в каждую лунку 6-луночного планшета так, чтобы нижние поверхности, прикрепленные к раковым клеткам яичников, были погружены в среду. Затем засейте по 1,5 миллилитра ГПМЦ в лунку каждого вкладыша и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 72 часа.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).