Моделирование метастазирования рака яичников в слизистой оболочке брюшинной полости: метод создания in vitro 3D-модели слизистой оболочки брюшины

Брюшина, или мембрана, выстилающая брюшную полость, представляет собой перитонеальные мезотелиальные клетки, поддерживаемые слоем фиброваскулярной соединительной ткани. Метастазирующие клетки рака яичников прилипают к этой перитонеальной слизистой оболочке и пролиферируют в раковые образования.

Чтобы смоделировать метастазирование рака яичников, начните с взятия человеческих фибробластов в коническую трубку и смешайте их с коллагеном — белком внеклеточного матрикса. Выложите суспензию на тарелку для культур. Инкубируйте для облегчения затвердевания коллагенового матрикса, чтобы внедрить фибробласты и имитировать соединительную ткань брюшины.

Далее добавьте суспензию мезотелиальных клеток поверх фибробласт-коллагенового слоя. Инкубируйте пластину, чтобы мезотелиальные клетки прилипли и образовали монослой на поверхности фибробласт-коллагенового слоя. Эта 3D-органотипическая культура теперь имитирует композицию и архитектуру выстилки брюшины in vivo.

Наконец, засейте эту органотипическую культуру клетками рака яичников и инкубируйте в течение желаемого времени. Раковые клетки яичников высвобождают определенные сигнальные молекулы, которые изменяют мезотелиальный слой, усиливая адгезию и инвазию раковых клеток, имитируя метастатические условия in vivo.

Чтобы освободить нормальные фибробласты сальника от посева, промойте колбу с культурой 10 миллилитрами PBS с последующим приемом 3 миллилитров трипсина в течение не более 5 минут. Когда клетки отделятся, нейтрализуйте трипсин, по крайней мере, в три раза превышающий объем полной питательной среды, и перенесите клетки в 50-миллилитровую коническую трубку. Раскрутите ячейки и повторно суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах полной питательной среды. Затем подсчитайте клетки и разведите их в соотношении от 2 до 4 раз по 10 до трети фибробласта на 100 микролитров полной концентрации питательной среды.

Затем добавьте 0,5 микрограмма на 100 микролитров коллагена I крысиного хвоста в клетки и нанесите 100 микролитров клеток на лунку в черную прозрачную 96-луночную пластину. Затем перенесите планшет в инкубатор для клеточных культур не менее чем на 4 часа или до тех пор, пока клетки не прилипнут к поверхности планшета. Пока нормальные фибробласты сальника оседают, отделите ГПМЦ от их культуральных колб и разбавьте эти клетки до 1-2 умно-10-четвертого ГПМЦ на 50 микролитров полной питательной среды.

Затем добавьте 50 микролитров ГПМЦ на лунку к прикрепленным нормальным фибробластам сальника и верните планшет в инкубатор для клеточных культур не менее чем на 18 часов перед экспериментальным использованием. На следующий день засейте 3D-органотипические культуры с GFP, экспрессирующими клетки рака яичников, из 80-90% сливающейся культуры в соответствующем разведении для желаемого последующего анализа.