$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Первичные мезотелиальные клетки человека, или ГПМЦ, выстилают многие висцеральные органы, такие как сальник или слой жировой ткани, присутствующий в брюшной полости.
Чтобы изолировать мезотелиальные клетки, начните с погружения образца сальника человека в подходящий буфер для удаления избытка эритроцитов или эритроцитов. Далее поместите сальник в стеклянную посуду и измельчите его на кусочки. Это диссоциирует ткань, высвобождая ГПМЦ вместе с загрязняющими эритроцитами.
Переложите детали в коническую трубку и дайте им оставаться неподвижными в течение желаемого времени. Богатый жиром низкой плотности фарш поднимается наверх, в то время как плотные клеточные компоненты оседают внизу. Далее отсасывайте жидкость на дне, содержащую ГПМЦ и эритроциты, в свежую пробирку.
Центрифуга для сбора ячеек. Удалите буферсодержащую надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в мезотелиальной питательной среде и инкубируйте в течение желаемого времени. Среда способствует избирательному росту ГПМЦ над эритроцитами.
Наблюдайте за клетками с помощью светового микроскопа, чтобы подтвердить рост мезотелиальных клеток человека кубовидной формы.
После получения хирургического образца сальника человека немедленно погрузите образец в PBS комнатной температуры. В течение 2 часов после погружения перенесите сальник в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 20 миллилитров свежего PBS. Перенесите оставшуюся жидкость PBS, содержащую первичные мезотелиальные клетки человека или ГПМЦ и эритроциты, в новую 50-миллилитровую коническую пробирку и поверните клетки вниз.
Затем высыпьте содержимое пробирки в 10-сантиметровую стерильную чашку для культивирования и с помощью двух скальпелей измельчите ткань на кусочки объемом 5 кубических миллиметров. Чтобы изолировать первичные мезотелиальные клетки человека или ГПМЦ, перенесите кусочки сальника в 50-миллилитровую коническую пробирку и подождите 1 минуту, пока твердые кусочки всплывут наверх. ГПМЦ поселится на дне пробирки с эритроцитами.
С помощью пипетки перенесите промывку PBS, содержащую мезотелиальные клетки и эритроциты, в пробирку, содержащую гранулированные клетки, и поверните их вниз. Затем добавьте 20 миллилитров свежего PBS в сальник и соберите PBS-содержащие ГПМЦ и эритроциты еще три раза, как только что продемонстрировали исходные гранулированные клетки.
После финального отжима поместите ячейки в колбу площадью 75 квадратных сантиметров в 15 миллилитрах полной питательной среды. Чтобы выделить дополнительный ГПМЦ из образца сальника, встряхните оставшуюся твердую ткань в 20 миллилитрах PBS при 200 об/мин и 37 градусах Цельсия. Через 10 минут дайте образцу отдохнуть в течение 1 минуты, чтобы твердая ткань поднялась к верхней части пробирки.
Затем соберите ГПМЦ и эритроциты со дна пробирки, как показано только что на рисунке. Теперь открутите ячейки из вторичной промывки и поместите их в отдельную колбу площадью 75 квадратных сантиметров в 15 миллилитрах полной питательной среды. Чтобы изолировать оставшийся ГПМЦ, встряхните ткань еще 10 минут, на этот раз в смеси PBS и 10 миллилитров трипсина-ЭДТА, и поместите эти ГПМЦ и эритроциты в колбу площадью 75 квадратных сантиметров.
Затем инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа во влажной среде. Скармливание покрытых клеток 15 миллилитров свежей полноценной питательной среды на 3 и 5 день, не удаляя отработанную среду. ГПМЦ можно идентифицировать по их кубовидной форме и экспрессии цитокератина-8 и виментина.