Анализ мезотелиального клиренса: метод in vitro для количественной оценки способности инвазионных сфероидов рака яичников в монослои мезотелиальных клеток

Во время метастазирования рака яичников злокачественные клетки отделяются от первичного опухолевого очага и начинают циркулировать в брюшной полости. Эти клетки затем могут образовывать кластеры или сфероиды, которые прилипают к монослою мезотелиальных клеток, выстилающему брюшную полость. По мере роста опухоли она очищает нижележащие мезотелиальные клетки, чтобы облегчить инвазию.

Чтобы смоделировать мезотелиальный клиренс, начните с посева мезотелиальных клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок или GFP, в чашку для культуры со стеклянным дном, покрытую фибронектином. Покрытие из фибронектина обеспечивает матрицу, способствующую прикреплению клеток. Инкубируйте чашку, чтобы мезотелиальные клетки распространились и образовали монослой.

Затем перенесите суспензию сфероидов клеток рака яичников, экспрессирующих красный флуоресцентный белок, на мезотелиальный монослой. Визуализируйте культуру в течение длительного времени с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии. Краснофлуоресцентные сфероиды осядут и прикрепятся к зелено-флуоресцентному мезотелиальному монослою.

Раковые клетки оказывают воздействие на мезотелиальные клетки, нарушая клеточные соединения и изменяя целостность мезотелиального слоя. Эта сила также смещает нижележащие мезотелиальные клетки, создавая дыру. Выберите подходящий параметр фильтра GFP, чтобы визуализировать результирующее отверстие в виде черного пространства на изображении. Измерьте пространство для количественной оценки степени мезотелиального клиренса.

Чтобы начать эту процедуру, предварительно покройте фибронектином лунки 6-луночной чашки MatTek со стеклянным дном. Добавьте по 2 миллилитра раствора фибронектина/PBS в каждую лунку посуды и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут. Зеленые флуоресцентные мезотелиальные клетки, экспрессирующие белки, для формирования монослоя мезотелиальных клеток культивируют в 10% основной среде. Трипсинизируйте пластину мезотелиальных клеток и вращайте в настольной центрифуге со скоростью 900 оборотов в минуту в течение трех минут.

Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 10% базовой среде. Доведите до нужной концентрации с 10% базовой средой. Когда 30-минутная инкубация фибронектина чашки MatTek будет завершена, промойте лунки 2 миллилитрами PBS. Отсасывайте PBS и наносите в тарелку 6 раз по 10 до пятой мезотелиальных клеток на лунку в каждой лунке 6-луночной чашки MatTek. Инкубируйте чашку MatTek в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия на ночь, чтобы мезотелиальные клетки прикрепились к чашке и образовали монослой.

Используйте пипетку для сбора сфероидов рака яичников с 96-луночного планшета с покрытием poly-HEMA. Аспирируйте среду из одной лунки 6-луночной чашки MatTek, содержащей монослой мезотелиальных клеток. Умойтесь один раз 2 миллилитрами PBS. Добавьте все сфероиды из 96-луночной пластины в одну лунку чашки MatTek. Это примерно в три раза больше, чем количество сфероидов, которые будут визуализированы, чтобы объяснить приземление сфероидов на ту часть тарелки, которая не может быть изображена.

Поскольку мы хотим получить изображение только одного сфероида в поле зрения, необходимо избегать агрегации сфероидов. Осторожно покачивайте чашку из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить сфероиды по монослою перед тем, как они прикрепятся.

Поместите чашку MatTek на столик инвертированного широкопольного флуоресцентного микроскопа, способного выполнять покадровую съемку в течение не менее восьми часов. Используйте моторизованный столик для отображения нескольких положений в чашке с несколькими событиями интеркаляции сфероидов в одном эксперименте. Сфероиды раковых клеток яичников осядут на дно посуды и прикрепятся к монослою мезотелиальных клеток. Собирайте GFP, RFP и фазовые изображения более 20 взаимодействий сфероидов и монослоев каждые десять минут в течение восьми часов.