Окошко яиц: метод вскрытия скорлупы оплодотворенного куриного яйца для обнажения сосудистой сети хориоаллантоисной мембраны

В оплодотворенном курином яйце хориоаллантоисная мембрана или CAM представляет собой сильно васкуляризированный слой, расположенный ниже внутренней мембраны яичной скорлупы. Он функционирует для поддержки развития эмбриона.

Чтобы продемонстрировать полностью развитую CAM, начните с размещения свечника для яиц - яркого источника света - напротив яичной скорлупы, чтобы визуализировать внутреннюю часть яйца. Расположите воздушную камеру между внешней и внутренней мембранами яичной скорлупы и выступающей ветвящейся сосудистой сетью внутри яйца. Обозначьте их позиции внешне.

В этих местах сделайте небольшие круглые отверстия в яичной скорлупе, чтобы обнажить подлежащую белую оболочку скорлупы. Аккуратно проколите обнаженную мембрану в обоих местах, не нарушая работу CAM и не вызывая альбумина или утечки крови.

Держа яйцо в продольном положении, приложите всасывание к отверстию естественной воздушной камеры, чтобы забрать воздух изнутри. Возникающее отрицательное давление опускает CAM ниже второго отверстия, создавая искусственную воздушную ячейку над сосудистой сетью.

Наметьте перемещаемую воздушную камеру. Разрежьте яичную скорлупу на несколько сантиметров внутрь контура, не нарушая границу воздушной ячейки и CAM. Удалите надрезанную оболочку, чтобы создать большое окно, обнажив нижележащий CAM и сосудистую сеть. Используйте прозрачную пленку, чтобы закрыть окошко на жизнеспособных яйцах.

На 7-й или 8-й день развития, когда КАМ полностью разовьется, выключите яйцевращатель и поместите примерно от 1 до 3 яиц в решетку для яиц в шкафу биобезопасности. При выключенном свете приложите свеч к яичной скорлупе, чтобы определить и отметить местоположение воздушной камеры одного яйца. Затем переместите свечник для яиц по скорлупе, чтобы найти большую сеть кровеносных сосудов, поворачивая яйцо по мере необходимости.

Идеальная сосудистая сеть должна разветвляться примерно в середине яйца. С помощью маркера проследите сосудистую сеть, которая будет использоваться для имплантации. Включив свет в капоте, используйте аккумуляторный вращающийся инструмент, оснащенный шлифовальным камнем из карбида кремния, чтобы просверлить небольшое отверстие в корпусе прямо над центром воздушной камеры. Когда большая часть оболочки будет удалена, но с белой внутренней мембраной, просверлите еще одно небольшое отверстие, где сосудистое окно будет открыто, как показано выше. Когда второе отверстие будет готово, с помощью иглы 18 калибра аккуратно проткните белую внутреннюю мембрану над воздушной камерой и сосудистой системой, следя за тем, чтобы белая внутренняя мембрана, но не CAM, была нарушена по всей просверленной области.

Когда свет вытяжки снова выключен, используйте свеч для яиц, чтобы убедиться, что воздушная камера была перенесена с конца яйца в область над сосудистой сетью. При необходимости поместите вакуумную трубку, вставленную в контроллер дозатора, вокруг отверстия над исходной воздушной камерой и осторожно применяйте всасывание короткими порциями, чтобы переместить воздушную камеру. Отметьте контур нового местоположения воздушной камеры, примерно на 0,5 см от границы air-CAM, и закрепите кусок упаковочной ленты ровно настолько, чтобы закрыть отверстие над новой воздушной камерой.

После подготовки двух других яиц, как показано выше, верните яйца в инкубатор и откройте все дополнительные яйца для эксперимента в группах от 1 до 3, как показано на рисунке. Когда все яйца будут открыты, перенесите от 1 до 3 яиц с перемещенными воздушными ячейками на решетку для яиц в шкафу биобезопасности и с помощью аккумуляторного вращающегося инструмента, оснащенного круглым режущим кругом, прорежьте небольшую линию через границу воздушной камеры полностью через ячейку без нарушения CAM или сосудистой системы. С помощью изогнутых ножниц разрежьте оставшуюся воздушную камеру, чтобы создать окно в скорлупе и убедиться в жизнеспособности эмбриона.

Жизнеспособные эмбрионы будут демонстрировать обширную сосудистую систему, прозрачный белок, движение эмбриона и/или видимое сердцебиение. У нежизнеспособных эмбрионов КАМ может казаться непрозрачным с небольшим количеством сосудов или вообще без них, а эмбрионы могут быть маленькими или отсутствовать без движения или сердцебиения. С помощью щипцов Semken вытяните небольшие кусочки ваты из стерильного ватного тампона и аккуратно промокните поверхность CAM жизнеспособных эмбрионов, чтобы удалить пыль и мусор. Затем закройте отверстие скорлупы куском прозрачной пленочной повязки размером 6 на 7 сантиметров, не касаясь САМ, и верните яйца в инкубатор открытым окном вверх. Используйте кусок решетки для яиц, край вращателя яиц или другой подходящий предмет для подпирания яиц, которые продолжают катиться.