Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 3:26 мин. • April 30th, 2023
Хориоаллантоисная мембрана курицы, или CAM, представляет собой сильно васкуляризированную мембрану, обнаруженную в яйцах некоторых позвоночных, таких как курицы. Эта внеэмбриональная мембрана выстилает несосудистую оболочку и функционирует как место обмена газообразным кислородом и углекислым газом между эмбрионом и окружающей средой.
Чтобы создать модель рака CAM, начните с жизнеспособного, оплодотворенного куриного яйца, несущего полностью развитый CAM с частично открытой оболочкой, которая обнажает его ветвящуюся сосудистую сеть. Убедитесь, что CAM отсоединен от мембраны оболочки.
Наденьте стерильное антипригарное кольцо на точку ответвления кровеносного сосуда. С помощью стеклянного стержня аккуратно потрите мембрану внутри кольца, чтобы соскоблить его внешний эпителиальный слой и обнажить нижележащий мезодермальный слой, несущий сосудистую сеть. Пипет охлажденную суспензию раковых клеток смешивают с подходящим внеклеточным матриксом в кольцо. Кольцо ограничивает клеточное рассеивание.
Дайте матрице затвердеть, чтобы обезопасить клетки внутри. Закройте отверстие скорлупы и инкубируйте яйцо в соответствующих условиях. Плотная сосудистая сеть в мезодермальном слое снабжает раковые клетки кислородом и необходимыми питательными веществами, тем самым обеспечивая подходящую микросреду для их роста и расширения.
Чтобы приготовить суспензию раковых клеток для трансплантации, соберите клетки из интересующей культуры раковых клеток и осадите клетки с помощью центрифугирования. Аспирируйте надосадочную жидкость и механически ресуспендируйте клетки в остаточной среде. Поместите клеточную суспензию на лед и с помощью пипетки измерьте объем клеток в среде. Затем ресуспендируйте клетки в концентрации от 1 до 2 миллионов клеток в 20-100 микролитрах среды, дополненной 2,7-4 миллиграммами на миллилитр внеклеточного матрикса и любыми факторами роста или другими добавками, представляющими интерес.
Для имплантации раковых клеток с помощью антипригарного кольца поместите до 6 яйцеклеток, подлежащих имплантации, на решетку для яиц и поверните края прозрачной пленочной повязки к открытому окну, чтобы удалить пленку со скорлупы. Проверьте, жизнеспособны ли и здоровы ли яйца. Идеальные яйца должны иметь большой сосуд с более мелкими ветвящимися сосудами в пределах центра открытого участка.
С помощью изогнутых щипцов радужной оболочки поместите стерильное антипригарное кольцо на CAM над сосудом, в идеале над точкой ветвления. С помощью стерильного стеклянного стержня аккуратно истирайте CAM и нанесите пипетку суспензии раковых клеток в центр кольца. Когда все клетки будут доставлены, запечатайте отверстие кусочком прозрачной пленки размером 6 на 7 см размером одна четверть и пометьте яйцеклетку соответствующим обозначением имплантата. Затем надежно поместите яйцо в инкубатор так, чтобы отверстие скорлупы было обращено вертикально.