Агарозный спин-даун-анализ: метод встраивания органоидов для гистологического анализа

Трехмерные органоидные культуры раковых клеток повторяют многие патофизиологические особенности рака человека. Таким образом, эти культуры in vitro образуют отличную модель для исследования рака.

Для обработки этих органоидов начните с культуры предварительно сформированных 3D-органоидов, выращенных в подходящей матрице базальной мембраны. Добавьте желаемую среду для восстановления клеток и инкубируйте. Среда способствует деполимеризации матричного геля, высвобождая 3D-органоиды в раствор.

Центрифугируйте эту смесь для гранулирования органоидов. Восстановительная среда, содержащая компоненты матрицы, остается в надосадочной жидкости. Выбросьте надосадочную жидкость. Далее добавьте раствор параформальдегида в гранулу органоида. Химическое вещество проникает в органоидные клетки и связывается с аминокислотами, вызывая сшивание белков и фиксацию образцов. Этот шаг жизненно важен для любых последующих гистологических применений.

Гранулируйте органоиды для отделения и удаления параформальдегидсодержащей надосадочной жидкости. Добавьте к органоидам теплую растопленную агарозу. С помощью иглы отделите и диспергируйте гранулированные органоиды в жидкой агарозе. Дайте агарозе застыть и внедрите органоиды. Используйте органоидсодержащую агарозную пробку для последующих гистологических анализов.

Чтобы обработать органоиды для гистологии, удалите существующую среду из лунки, стараясь не аспирировать купола базальной мембраны. Добавьте равный объем раствора для восстановления клеток и инкубируйте планшет в течение 60 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

После инкубации с помощью пипетки сместите купол базальной мембраны и раздавите его наконечником пипетки. Соберите диссоциированный купол и раствор для восстановления клеток в 1,5-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте пробирку при температуре 300 x g и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут, затем удалите надосадочную жидкость и отложите ее в сторону.

Сохраните весь надосадочный слой до финального этапа, когда наличие органоидов подтвердится. Добавьте желаемый объем холодной PBS и аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы механически выбить гранулу без нарушения органоидов. Повторите центрифугирование и удалите надосадочную жидкость.

Зафиксируйте гранулу в согласованном объеме 4% ПФА на 60 минут при комнатной температуре. После фиксации повторите этап центрифугирования и промывки PBS. Затем медленно добавьте 200 микролитров теплой 2% агарозы и немедленно, но аккуратно отделите клеточную гранулу от стенки трубки, не нарушая ее, с помощью иглы 25 калибра, прикрепленной к шприцу объемом 1 миллилитров.

При использовании метода отжима агарозы крайне важно отсоединить клеточную гранулу от стенки пробирки сразу после добавления агарозы с помощью иглы 25 калибра.

Как только агароза полностью застынет, отсоедините ее от пробирки с помощью иглы 25 калибра, прикрепленной к 1-миллилитровому шприцу, и переложите в новую 1,5-миллилитровую трубку. Наполните пробирку 70% этанолом и продолжайте следовать обычному протоколу обезвоживания тканей и введения парафина.