Агарозный спин-даун-анализ: метод встраивания органоидов для гистологического анализа

Трехмерные органоидные культуры раковых клеток повторяют многие патофизиологические особенности рака человека. Таким образом, эти культуры in vitro образуют отличную модель для исследования рака.

Для обработки этих органоидов начните с культуры предварительно сформированных 3D-органоидов, выращенных в подходящей матрице базальной мембраны. Добавьте желаемую среду для восстановления клеток и инкубируйте. Среда способствует деполимеризации матричного геля, высвобождая 3D-органоиды в раствор.

Центрифугируйте эту смесь для гранулирования органоидов. Восстановительная среда, содержащая компоненты матрицы, остается в надосадочной жидкости. Выбросьте надосадочную жидкость. Далее добавьте раствор параформальдегида в гранулу органоида. Химическое вещество проникает в органоидные клетки и связывается с аминокислотами, вызывая сшивание белков и фиксацию образцов. Этот шаг жизненно важен для любых последующих гистологических применений.

Гранулируйте органоиды для отделения и удаления параформальдегидсодержащей надосадочной жидкости. Добавьте к органоидам теплую растопленную агарозу. С помощью иглы отделите и диспергируйте гранулированные органоиды в жидкой агарозе. Дайте агарозе застыть и внедрите органоиды. Используйте органоидсодержащую агарозную пробку для последующих гистологических анализов.

Чтобы обработать органоиды для гистологии, удалите существующую среду из лунки, стараясь не аспирировать купола базальной мембраны. Добавьте равный объем раствора для восстановления клеток и инкубируйте планшет в течение 60 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

После инкубации с помощью пипетки сместите купол базальной мембраны и раздавите его наконечником пипетки. Соберите диссоциированный купол и раствор для восстановления клеток в 1,5-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте пробирку при температуре 300 x g и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут, затем удалите надосадочную жидкость и отложите ее в сторону.

Сохраните весь надосадочный слой до финального этапа, когда наличие органоидов подтвердится. Добавьте желаемый объем холодной PBS и аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы механически выбить гранулу без нарушения органоидов. Повторите центрифугирование и удалите надосадочную жидкость.

Зафиксируйте гранулу в согласованном объеме 4% ПФА на 60 минут при комнатной температуре. После фиксации повторите этап центрифугирования и промывки PBS. Затем медленно добавьте 200 микролитров теплой 2% агарозы и немедленно, но аккуратно отделите клеточную гранулу от стенки трубки, не нарушая ее, с помощью иглы 25 калибра, прикрепленной к шприцу объемом 1 миллилитров.

При использовании метода отжима агарозы крайне важно отсоединить клеточную гранулу от стенки пробирки сразу после добавления агарозы с помощью иглы 25 калибра.

Как только агароза полностью застынет, отсоедините ее от пробирки с помощью иглы 25 калибра, прикрепленной к 1-миллилитровому шприцу, и переложите в новую 1,5-миллилитровую трубку. Наполните пробирку 70% этанолом и продолжайте следовать обычному протоколу обезвоживания тканей и введения парафина.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
• Underlying Mechanisms – Description of the procedure to detach and process organoids (e.g., cell recovery solution).
• Connect to Experiment – Explanation of the importance of proper organoid and agarose handling in the experiment.

• What is the spin-down technique and how is it applied in the procedure?
• How does organoid paraffin embedding contribute to tissue preservation?
• What role does cell recovery solution play during the dissociation of organoids?

• Practical Applications – Spin-down and embedding techniques in biological and medical research (e.g., spin-down).
• Industry Impact – Areas like pathology and histology benefit from these methods (e.g., organoid paraffin embedding).
• Societal Importance – Advancement in disease diagnosis and treatment (e.g., cell recovery solution).
• Link to Scientific Advancements – Development of improved tissue preservation and analysis methods.