Анализ органоидов предстательной железы: метод культивирования ex vivo на основе матричного геля для изучения дифференцировочной способности эпителиальных клеток предстательной железы

Эпителий предстательной железы в основном состоит из клеток базального эпителия и эпителия просвета. Монослой базальных клеток образует внешнюю оболочку железы и поддерживает выживание люминальных клеток. И наоборот, люминальные клетки выстилают просвет и секретируют белки, специфичные для простаты.

Чтобы изучить дифференцировку эпителия предстательной железы ex vivo, начните с суспензии клеток базального эпителия предстательной железы. Смешайте суспензию с охлажденной матрицей базальной мембраны в нужном соотношении. Пипетируйте эту смесь рядом с основанием внутренней стенки клетки-репеллентной культуральной пластины. Закрутите пластину, чтобы смесь образовала кольцо по окружности лунки.

Инкубируйте пластину, чтобы матрица затвердела. Дополните культуру предпочтительной средой. Факторы роста в среде поддерживают пролиферацию базальных эпителиальных клеток. В то же время, репеллентная природа чашки для культивирования предотвращает любое прикрепление клеток, стимулируя клетки к образованию трехмерных сфероидов внутри матрицы.

Со временем сфероиды развивают просветы, окаймленные многослойным эпителием. Базальные эпителиальные клетки, выстилающие просвет, в конечном итоге дифференцируются и образуют секреторные люминальные клетки, давая начало трехмерным железистым структурам.

Начните эту процедуру с препарирования базальных и просветных эпителиальных клеток предстательной железы мыши, как описано в текстовом протоколе. Промойте клеточную гранулу в 500 микролитрах мышиной органоидной среды. Затем повторно суспендируйте гранулу при плотности клеток 1000 клеток на микролитр. Для приготовления мастер-смесей смешайте эпителиальные клетки, взвешенные в органоидной среде мыши, с матриксным гелем для получения окончательной смеси, содержащей 25% клеток в среде и 75% матриксного геля. В зависимости от последующего применения, базальные клетки обычно покрываются в концентрации от 100 до 2000 клеток на 80 микролитров, тогда как люминальные клетки покрываются концентрацией от 2000 до 10000 клеток на 80 микролитров.

Для каждой клеточной смеси добавьте 80 микролитров матричного геля на лунку 24-луночного планшета. Пипетируйте каплю на нижнюю половину стенки лунки, избегая при этом прямого контакта с покрытием poly-HEMA. После добавления матричного геля поверните пластину, чтобы смесь ячеек матричного геля образовала кольцо вокруг края лунки. Поместите 24-луночный планшет в инкубатор с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия лицевой стороной вверх на 10 минут, чтобы матричный гель частично затвердел.

После инкубации в течение 10 минут переверните 24-луночный планшет вверх дном и инкубируйте еще 50 минут, чтобы матричный гель полностью затвердел. Затем добавьте по 350 микролитров предварительно подогретой органоидной среды для мыши, по каплям, в центр каждой лунки. После добавления среды верните 24-луночный планшет в инкубатор.

Чтобы пополнить органоидную среду мыши, наклоните 24-луночный планшет под углом 45 градусов и аккуратно удалите существующую среду из центра каждой лунки с помощью пипетки P1000, избегая матричного гелевого кольца. Добавьте 350 микролитров предварительно подогретых органоидных сред для мыши, как и раньше. Рекомендуется добавлять больший объем среды к органоидам, культивируемым дольше пяти дней, чтобы предотвратить быстрое истощение ключевых питательных веществ и факторов роста.

• Prostate Epithelium - Consists of basal and luminal cells forming the prostate gland's structure.
• Basal Cells - Cells forming the outer lining of the prostate epithelium.
• Luminal Cells - Cells lining the lumen of the prostate gland and secreting prostate-specific proteins.
• 3D Spheroids - Cell structures formed in a cell-repellent environment.
• Organoid Assay - A method to study cell differentiation and formation of 3D glandular structures ex vivo.

• Introduction to Prostate Epithelium - It is formed of basal and luminal cells (e.g., prostate epithelial cells).
• Outline of Cellular Components - Basal cells support luminal cell survival; luminal cells line the lumen (e.g., organoid assay).
• Explanation of 3D Spheroids Formation - Grown within a matrix in a cell-repellent environment.
• Connection to Experiment - Formation of luminal cells from basal cells in 3D glandular structures.

• What are prostate epithelial cells and their role in the prostate epithelium?
• How does the organoid assay contribute to the study of prostatic epithelial differentiation?
• What is the process of 3D spheroids formation in a cell-repellent environment?

• Practical Applications - Used to study cell differentiation and formation of glandular structures ex vivo (e.g., organoid assay).
• Industry Impact - Crucial for biomedical research and development in urology (e.g., prostate health).
• Societal Importance - Contributes to better understanding and treatment of prostate diseases (e.g., prostate cancer).
• Scientific Advancements - Enabled the study of prostate cell proliferation and differentiation.