Экстракция лизата белка: метод лизиса органоидов для сбора клеточных белков

Лизат клеток, или жидкость, содержащая лизированное содержимое клеток, находит применение в последующих процессах, таких как экстракция и анализ белка. Изучение этих дробей позволяет получить информацию о характеристиках и функциях клеток.

Чтобы получить лизаты органоидных белков, начните с культуры органоидов, выращенных в нужной матрице базальной мембраны. Удалите отработанную питательную среду из чашки. Добавьте на матрицу теплые среды, содержащие протеазы. Пипеткой несколько раз выбить матрицу из чашки.

Инкубируйте смесь. Протеолитические ферменты в среде разрушают матрицу и высвобождают органоиды в раствор. Центрифугируйте образец для отделения органоидов от надосадочной жидкости, содержащей фермент

Ресуспендируйте органоидную гранулу в подходящем буфере для лизиса белка. Инкубируйте образец. Детергенты в буфере разрушают клеточные мембраны органоидов, высвобождая внутриклеточное содержимое в раствор. В то же время белковые ингибиторы в буфере инактивируют любые высвобождающиеся ферменты протеазы и фосфатазы, предотвращая деградацию их белков субстрата.

Далее обработайте смесь ультразвуком, чтобы нарушить работу клеток полностью. Ядерная оболочка разрывает и высвобождает ядерные белки в раствор. Звуковые волны также сдвигают высвобождаемые нуклеиновые кислоты, предотвращая их загрязнение белкового лизата.

Чтобы собрать органоиды, многократно продуйте матричный гель, пипетируя 1 миллилитр предварительно подогретой диспазосодержащей среды непосредственно на матричное гелевое кольцо до тех пор, пока все кольцо не будет смещено. Перенесите вытесненную матричную гелевую органоидную смесь в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. После полного разложения, как описано в текстовом протоколе, добавьте фосфатно-солевой буфер в органоидную гранулу и повторно суспендируйте, осторожно взбивая.

Гранулируйте органоиды центрифугированием при концентрации 800 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки. Ресуспендируйте гранулы органоидов в 100 микролитрах буфера для лизиса белка на 10 микролитров объема упакованной клетки. Проведите по экрану для повторного выполнения. Теперь произведите ультразвуковую обработку органоидов, погрузив трубки во влажный лед и осторожно приложив наконечник звукового дисмембранора к внешней стороне микроцентрифужной трубки. Обрабатывайте ультразвуком в течение 40 секунд на частоте 20 кГц, прежде чем приступить к вестерн-блоттингу в соответствии с установленными протоколами.