Отбор проб одиночных клеток с помощью микродиссекции с лазерным захватом: метод забора клеток-мишеней из гетерогенной клеточной популяции

Микродиссекция с лазерным захватом позволяет получить одну клетку-мишень из клеточной смеси, приготовленной на предметном стекле. Начните с того, что возьмите на его поверхность подходящее предметное стекло, покрытое УФ-проницаемой, биохимически инертной мембраной. Подвергните предметное стекло воздействию ультрафиолетового света, чтобы сделать его более гидрофильным для лучшей адгезии клеток.

Соберите предметное стекло в цитоцентрифугу. Добавьте клеточную суспензию на воронку аппарата. Цитоцентрифуга позволяет центробежной силе концентрироваться и осаждать монослой клеток на небольшой площади на предметном стекле. Дайте предметному стеклу высохнуть на воздухе.

Поместите предметное стекло стороной вверх под лазерный микродиссекционный микроскоп. Определите область, окружающую интересующую ячейку. Теперь сфокусируйте лазерный луч, чтобы рассекать область, содержащую клетку-мишень, вместе с мембранным покрытием. Затем расфокусируйте лазерный луч и импульсируйте его для создания давления. Эта энергия катапультирует микрорасчлененную область в перевернутую крышку предварительно собранной сборной трубки, содержащей буфер, расположенный над предметным стеклом.

Достаньте пробирку и закройте крышку. Вращайте трубку, чтобы поднести буфер, содержащий одну целевую ячейку, ко дну пробирки. Охладите трубку до дальнейшего анализа.

Для лазерной микродиссекции цитоцентрифугируйте все 300 микролитров клеточной суспензии на предметное стекло с мембранным покрытием при плотности 300 x g в течение 5 минут. Затем поместите предметное стекло с мембранным покрытием на микроскоп, способный проводить лазерную микродиссекцию. Далее пипетку 4,5 микролитра мастера лизиса клеток смешать в колпачок 0,2-миллилитровой ПЦР-пробирки.

Поместите колпачок над образцом и соберите одну клетку с помощью лазерной микродиссекции. Сразу после этого проверьте наличие изолированных клеток в ПЦР-колпачке. Извлеките ПЦР-пробирку из лазерного микроскопа для микродиссекции и закройте пробирку. Соберите всю жидкость на дно трубки с помощью короткого отжима.