Получение клеток хеморезистентного рака предстательной железы: процедура получения лекарственно-устойчивых раковых клеток in vitro

Чтобы получить химиорезистентные клетки, начните с приема суспензии клеток рака предстательной железы человека в колбе для культур. Инкубируйте колбы, чтобы облегчить сцепление клеток и их деление с образованием монослоя.

Дополните клетки раствором противоракового препарата в оптимальной концентрации и инкубируйте. Молекулы препарата проникают в клетки и вызывают апоптоз в чувствительных клетках.

Некоторые клетки выделяют специальные транспортеры оттока лекарств или насосы, которые периодически удаляют лекарства. Этот механизм предотвращает накопление лекарств, позволяя этим клеткам противостоять действию противораковых препаратов и становиться химиорезистентными.

Отсасывайте из культуры среды, содержащие лекарственные средства и мусор. Добавляйте свежие немедикаментозные питательные среды для поддержки роста химиорезистентных клеток. Выбросьте отработанные среды. Трипсинизируйте клетки, чтобы отделить их от колбы с культурой и перенести в пробирку.

Центрифугируйте пробирку для гранулирования клеток. Удалите трипсин-содержащий надосадочный жидкость. Ресуспендируйте клетки в свежих питательных средах. Выращивайте клетки в колбе с новой культурой.

Впоследствии повторите этапы лечения препаратом и культивирования клеток, чтобы подвергнуть химиорезистентные клетки воздействию возрастающих доз того же противоракового препарата. Этот метод позволяет проводить скрининг культуры путем удаления всех чувствительных клеток для создания пула выживших клеток с высокой химиорезистентностью.

Чтобы начать эту процедуру, поместите ячейки DU145 или 22Rv1 в 150-сантиметровые квадратные колбы, содержащие 20 миллилитров среды. Через 24 часа, когда клетки находятся на уровне от 70% до 80% слияния, добавьте доцетаксел в концентрации 5 наномоляров.

Через 72 часа аспирируйте лекарственную среду и добавьте свежую среду, не содержащую доцетаксела. Меняйте среду каждые 3-4 дня и подождите от 1 до 2 недель, пока в колбе не появятся клоны. Аспирируйте СМИ. Тщательно промойте клетки 15 миллилитрами PBS и инкубируйте их с 4 миллилитрами 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 3-5 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы оторвать клетки от поверхности колбы. Затем повторно суспендируйте трипсинизированные клетки из колбы, используя 8 миллилитров свежей среды.

Соберите ячейки из всех обработанных колб и гранулируйте их методом центрифугирования. После этого удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 20 миллилитрах свежей среды и поместите клетки в 150-сантиметровые квадратные колбы.

Через 24 часа, когда клетки находятся примерно на 70-80% конфлюенции, снова добавьте 5 наномолярных доцетакселов. Повторяйте процедуры, как показано ранее, до тех пор, пока клоны не появятся в колбе. Затем снова разложите ячейки по 150-сантиметровым квадратным колбам.

Через 24 часа, когда клетки находятся на уровне от 70% до 80% слияния, обработайте их 10 наномолярными доцетакселами. Повторяйте те же шаги по возрастанию дозы доцетаксела и продолжайте объединять выжившие клоны после каждой концентрации. В конце процесса вы получите пул устойчивых клеток, готовых к экспериментальному использованию.