Индукция аутофагии на основе ADI в клетках рака предстательной железы: метод измерения аутофагического ответа в клетках на основе ферментов

Аутофагия — это внутриклеточный процесс, который способствует деградации нежелательных цитоплазматических компонентов и органелл в специализированных пищеварительных компартментах, называемых лизосомами. Чтобы оценить аутофагию, начните с адгезивной культуры клеток рака предстательной железы, экспрессирующих аутофагические маркерные белки, называемые LC3, связанные с зелеными флуоресцентными белками.

По своей природе в клетках рака предстательной железы отсутствует фермент аргининосукцинатсинтаза, необходимый для синтеза аминокислот аргинина. Таким образом, выживание и пролиферация этих клеток зависят от внешних добавок аргинина через среду.

Далее обработайте клетки аргининдеиминазой или ADI. ADI гидролизует свободный аргинин в среде, что приводит к истощению запасов аргинина. Как следствие, клетки подвергаются метаболическому стрессу, инициируя аутофагическую реакцию изнутри. Одновременно обрабатывайте клетки красным флуоресцентным красителем, который помечает лизосомы внутри клеток.

Во время аутофагии чашеобразные мембранные структуры, называемые фагофорами, собираются вокруг поврежденных цитоплазматических компонентов. В конце концов, они расширяются и запечатывают свой груз, конъюгируя с аутофагическими маркерными белками LC3, образуя двухмембранные везикулы или аутофагосомы. Белки LC3 также обеспечивают флуоресцентные метки для аутофагосом. Затем везикулы сливаются с лизосомами, образуя аутолизосомы. Лизосомальные протеазы в аутолизосомах разрушают поглощенные клеточные компоненты.

В режиме реального времени наблюдайте за яркой флуоресценцией аутофагосом и лизосом, чтобы определить их распределение внутри клеток.

Для начала вырастите клетки рака предстательной железы человека, экспрессирующие зеленую флуоресцентную белок, связанную с белком, на 35-миллиметровых чашках для культуры со стеклянным дном, покрытых поли-D-лизином, как описано в текстовом протоколе.

Клетки должны быть покрыты с достаточной плотностью, чтобы способствовать быстрой пролиферации, но не настолько, чтобы клетки разрастались и комковались к моменту визуализации. Обрабатывайте выбранные образцы клеток аргининдезаминазой, или ADI, в PBS, чтобы истощить клетки свободного аргинина и вызвать метаболический стресс в раковых клетках.

Примерно за час до визуализации разбавьте 1,5 микролитра LysoTracker Red с 20 мл RPMI, содержащего 10% FBS и 1% антибиотиков. Приготовьте растворы с помощью ADI для выбранных образцов, которые были обработаны.

Прогрев все среды до 37 градусов по Цельсию, добавьте соответствующие среды в каждую тарелку для культуры. Инкубируйте клетки с RPMI, содержащим LysoTracker Red, в течение 15–45 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Примерно за 30 минут до начала съемки включите кожух метеостанции и обеспечьте равновесие до 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Промойте ячейки PBS и замените среду стандартным RPMI, содержащим только 10% FBS и 1% антибиотиков.

Добавьте ADI к образцам, как указано. Установите 35-миллиметровую покровную стеклянную посуду для культуры в специальный адаптер. Используйте иммерсионное масло на объективе с числовой апертурой 1,42 с 60-кратным увеличением и расположите установленную чашку для культуры на предметном столике микроскопа.