Экстракция белка и протеолиз: метод получения белков из образцов ткани опухоли предстательной железы и их ферментативного расщепления в пептиды
JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 4:03 мин • April 30th, 2023
Начните с образца ткани опухоли предстательной железы. Повторно суспендируйте его в охлажденном буфере для лизиса, чтобы начать лизис клеток. Используйте гомогенизатор для дальнейшего разрушения тканевых структур и высвобождения их внутриклеточных компонентов. Произведите ультразвуковую обработку образца на льду, чтобы обеспечить полный лизис клеток, и срежьте ДНК, чтобы предотвратить интерференцию во время обработки пептидов. Нагрейте лизат, чтобы нарушить третичную структуру белков и развернуться.
Восстановители в буфере расщепляют дисульфидные связи между остатками цистеина. Впоследствии алкилирующие агенты в буфере алкилируют свободные тиоловые группы восстановленных цистеинов для предотвращения образования дисульфидных связей. Дополнительные денатурирующие агенты в буфере способствуют контролируемой денатурации и дальнейшему развертыванию белков.
Центрифуга для гранулирования остатков тканей и любых загрязнений. Соберите надосадочную жидкость, содержащую белковую смесь, в свежую пробирку. Добавьте фермент лизилэндопептидазу, чтобы расщепить пептидные связи в белках на С-конце остатков лизина, образуя крупные пептиды. Кроме того, обработайте ферментом трипсином, чтобы расщепить пептидные связи на С-конце остатков лизина и аргинина и получить более мелкие пептиды. Переложите смесь в центробежный фильтрующий блок.
Центрифуга позволяет переваренным пептидам проникать через поры фильтрующей мембраны и собираться в виде протока. Любые более крупные фрагменты остаются в виде ретентата.
Чтобы собрать опухолевую ткань, взвесьте опухоль и добавьте в культуральную пробирку 2 миллилитра ледяного буфера для лизиса на каждые 100 миллиграммов ткани. Затем используйте ручной или настольный гомогенизатор для гомогенизации лизата.
Чтобы уменьшить и алкилировать образец, нагрейте пробирку до 95 градусов Цельсия в течение 5 минут, затем охладите образец на льду в течение 15 минут. Еще находясь на льду, трижды обработайте лизат ультразвуком. Затем нагрейте образец до 95 градусов Цельсия в течение 5 минут.
Поместите эту ультразвуковую трубку в вращающийся ротор ведра и центрифугируйте лизат при температуре 3500 x g и 15 градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем соберите надосадочную жидкость и выбросьте гранулу. Чтобы переварить лизат, используйте 100 миллимолярный трис, чтобы разбавить образец в 12 раз, чтобы уменьшить количество гуанидиния. Для получения 5 миллиграммов белка добавьте 10 микрограммов лизилэндопептидазы, или Lys-C, и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 5-6 часов.
Приготовьте 1 миллиграмм на миллилитр обработанного TPCK трипсина в 1 миллимолярном HCl с добавлением 20 миллимолярного хлорида кальция и трипсина в соотношении трипсина к белку 1 к 100. Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 3 часов. Затем добавьте в пробирку дополнительную аликвоту трипсина и инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.
Добавьте образец в 15-миллилитровый фильтр с отсечкой 10 кДа. Центрифугируйте образец в качающемся ведре или роторе с фиксированным углом наклона при температуре 3500 x g и 15 градусах Цельсия до тех пор, пока объем ретентата не станет менее 250 микролитров. Затем соберите проточный и выбросьте ретентат.
Обзор
В данной статье подробно описан протокол подготовки образцов тканей опухоли предстательной железы для пептидного анализа. Метод включает лизис клеток, денатурацию белков и ферментативное переваривание для подготовки образцов к дальнейшему анализу.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Протеомика
- Биология опухолей
Теоретические основы
- Понимание белкового состава опухолевых тканей имеет решающее значение для исследований рака.
- Пептидный анализ позволяет получить представление о биологии опухоли и потенциальных терапевтических мишенях.
- Данный протокол направлен на обеспечение полного лизиса и эффективного получения пептидов из образцов опухоли.
- Ферментативное расщепление является ключевым этапом подготовки образцов для масс-спектрометрического анализа.
Цель исследования
- Разработать надежный метод экстракции и переваривания белков из тканей опухоли предстательной железы.
- Обеспечить возможность анализа пептидов для исследования механизмов развития рака.
- Оптимизировать условия ферментативного переваривания для получения высококачественных образцов пептидов.
Используемые методы
- Ресуспендирование образцов ткани в лизирующем буфере для лизиса клеток.
- Использование гомогенизаторов и соникации для обеспечения полного лизиса.
- Применение восстанавливающих и алкилирующих агентов для подготовки белков к перевариванию.
- Ферментативное переваривание с использованием лизил-эндопептидазы и трипсина для получения пептидов.
Основные результаты
- Успешная экстракция белков из тканей опухолей предстательной железы.
- Эффективное получение пептидов, подходящих для анализа.
- Оптимизация условий ферментативного переваривания для обеспечения максимального выхода.
- Четкое отделение переваренных пептидов от более крупных фрагментов.
Выводы
- Разработанный протокол представляет собой надежный метод анализа пептидов из опухолевых тканей.
- Он может быть применен в исследованиях различных типов рака.
- Будущие исследования могут опираться на данный метод для дальнейшего изучения биологии опухолей.
Часто задаваемые вопросы
Прикладное значение для промышленности
Эффективная экстракция белков и протеолиз из тканей опухоли предстательной железы являются основой для поиска мишеней и исследования биомаркеров на ранних стадиях онкологии. Получение высококачественных пептидов позволяет проводить последующую количественную масс-спектрометрию, что повышает достоверность прогнозов при идентификации потенциальных мишеней. Данный рабочий процесс является базовым для трансляционных исследований, направленных на снижение рисков при проверке механистических гипотез в онкологических портфелях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет анализировать экспрессию опухолеспецифических белков и их посттрансляционные модификации.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем получения пептидов, подходящих для профилирования методом масс-спектрометрии.
- Способствует снижению механистических рисков за счет предоставления воспроизводимых образцов пептидов для сравнительных исследований.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных пептидных препаратов для разработки и оптимизации анализа.
- Гарантирует воспроизводимость и количественную согласованность между биологическими повторами.
- Подготавливает образцы для платформ высокопроизводительного скрининга и последующих этапов обогащения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты анализа пептидов с поиском трансляционных биомаркеров в исследованиях рака предстательной железы.
- Обеспечивает непрерывность процесса — от получения тканей до доклинической валидации потенциальных мишеней.
- Поддерживает продвижение с учетом рисков за счет проведения надежного сравнительного протеомного анализа.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол экстракции белков и протеолиза объединяет этапы ранних фундаментальных исследований и трансляционной медицины, обеспечивая получение высококачественных пептидных образцов для масс-спектрометрии и последующего омиксного анализа.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез при исследовании протеомов опухолей и картировании сигнальных путей.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых количественных образцов пептидов для подготовки анализов и масштабирования платформ.
- Аналитика: позволяет точно измерять содержание пептидов и статус их модификаций для проведения сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает экстракцию белков на уровне тканей с исследованиями по валидации биомаркеров и терапевтических мишеней.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный, применимый многократно протокол для различных типов опухолевых тканей и исследовательских программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при идентификации мишеней и понимании механизмов действия.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, масштабируемые и воспроизводимые рабочие процессы подготовки пептидов.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях в онкологических пайплайнах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и сопоставимость различных программ в трансляционных исследованиях.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с тканями, знания в области химии белков и протоколов ферментативного переваривания.
- Необходим доступ к оборудованию для гомогенизации, соникации и центрифугирования.
- Для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных требуется стандартизация между исследовательскими группами.
- Метод применим к различным типам опухолевых тканей при необходимости оптимизации протокола.
- Требуется строгое соблюдение правил обращения с образцами для предотвращения протеолитической деградации и контаминации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Водной Микробная Metaproteomics рабочего процесса: от клеток до триптической пептидов Подходит для тандемной масс-спектрометрии на основе анализа
Похожие видео
0 Просмотры
Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Характеристика клеточных белков с в-клеточной быстрой фотохимической окисления белков
Похожие видео
0 Просмотры
Очистка пептидов: метод извлечения пептидов из переваренных белковых лизатов на основе RP-ВЭЖХ
Похожие видео
0 Просмотры
Обогащение фосфопептидов на основе диоксида титана: метод селективного выделения фосфопептидов из пептидной библиотеки
Похожие видео
0 Просмотры
Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани
Похожие видео
0 Просмотры
Количественный масс-спектрометрический Профилирование раковых клеток протеомов, полученные из жидких и твердых опухолей
Похожие видео
0 Просмотры
Phosphopeptide обогащения, в сочетании с Label бесплатно количественного масс-спектрометрии для расследования Phosphoproteome рака простаты
Похожие видео
0 Просмотры
Секвенирование малых некодирующих РНК от формина-фиксированных тканей и сыворотки полученных экзосом от кастрации устойчивых больных раком предстательной железы
Похожие видео
0 Просмотры
Протеомический подход на основе масс-спектрометрии для глобального анализа R-метилирования белка с высокой степенью достоверности
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026