Экстракция белка и протеолиз: метод получения белков из образцов ткани опухоли предстательной железы и их ферментативного расщепления в пептиды

0 просмотров4:03 мин • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Начните с образца ткани опухоли предстательной железы. Повторно суспендируйте его в охлажденном буфере для лизиса, чтобы начать лизис клеток. Используйте гомогенизатор для дальнейшего разрушения тканевых структур и высвобождения их внутриклеточных компонентов. Произведите ультразвуковую обработку образца на льду, чтобы обеспечить полный лизис клеток, и срежьте ДНК, чтобы предотвратить интерференцию во время обработки пептидов. Нагрейте лизат, чтобы нарушить третичную структуру белков и развернуться.

Восстановители в буфере расщепляют дисульфидные связи между остатками цистеина. Впоследствии алкилирующие агенты в буфере алкилируют свободные тиоловые группы восстановленных цистеинов для предотвращения образования дисульфидных связей. Дополнительные денатурирующие агенты в буфере способствуют контролируемой денатурации и дальнейшему развертыванию белков.

Центрифуга для гранулирования остатков тканей и любых загрязнений. Соберите надосадочную жидкость, содержащую белковую смесь, в свежую пробирку. Добавьте фермент лизилэндопептидазу, чтобы расщепить пептидные связи в белках на С-конце остатков лизина, образуя крупные пептиды. Кроме того, обработайте ферментом трипсином, чтобы расщепить пептидные связи на С-конце остатков лизина и аргинина и получить более мелкие пептиды. Переложите смесь в центробежный фильтрующий блок.

Центрифуга позволяет переваренным пептидам проникать через поры фильтрующей мембраны и собираться в виде протока. Любые более крупные фрагменты остаются в виде ретентата.

Чтобы собрать опухолевую ткань, взвесьте опухоль и добавьте в культуральную пробирку 2 миллилитра ледяного буфера для лизиса на каждые 100 миллиграммов ткани. Затем используйте ручной или настольный гомогенизатор для гомогенизации лизата.

Чтобы уменьшить и алкилировать образец, нагрейте пробирку до 95 градусов Цельсия в течение 5 минут, затем охладите образец на льду в течение 15 минут. Еще находясь на льду, трижды обработайте лизат ультразвуком. Затем нагрейте образец до 95 градусов Цельсия в течение 5 минут.

Поместите эту ультразвуковую трубку в вращающийся ротор ведра и центрифугируйте лизат при температуре 3500 x g и 15 градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем соберите надосадочную жидкость и выбросьте гранулу. Чтобы переварить лизат, используйте 100 миллимолярный трис, чтобы разбавить образец в 12 раз, чтобы уменьшить количество гуанидиния. Для получения 5 миллиграммов белка добавьте 10 микрограммов лизилэндопептидазы, или Lys-C, и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 5-6 часов.

Приготовьте 1 миллиграмм на миллилитр обработанного TPCK трипсина в 1 миллимолярном HCl с добавлением 20 миллимолярного хлорида кальция и трипсина в соотношении трипсина к белку 1 к 100. Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 3 часов. Затем добавьте в пробирку дополнительную аликвоту трипсина и инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

Добавьте образец в 15-миллилитровый фильтр с отсечкой 10 кДа. Центрифугируйте образец в качающемся ведре или роторе с фиксированным углом наклона при температуре 3500 x g и 15 градусах Цельсия до тех пор, пока объем ретентата не станет менее 250 микролитров. Затем соберите проточный и выбросьте ретентат.

08:09

Водной Микробная Metaproteomics рабочего процесса: от клеток до триптической пептидов Подходит для тандемной масс-спектрометрии на основе анализа

Похожие видео

0 Просмотры

07:28

Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии

Похожие видео

0 Просмотры

09:03

Характеристика клеточных белков с в-клеточной быстрой фотохимической окисления белков

Похожие видео

0 Просмотры

03:21

Очистка пептидов: метод извлечения пептидов из переваренных белковых лизатов на основе RP-ВЭЖХ

Похожие видео

0 Просмотры

03:33

Обогащение фосфопептидов на основе диоксида титана: метод селективного выделения фосфопептидов из пептидной библиотеки

Похожие видео

0 Просмотры

09:20

Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани

Похожие видео

0 Просмотры

08:08

Количественный масс-спектрометрический Профилирование раковых клеток протеомов, полученные из жидких и твердых опухолей

Похожие видео

0 Просмотры

12:23

Phosphopeptide обогащения, в сочетании с Label бесплатно количественного масс-спектрометрии для расследования Phosphoproteome рака простаты

Похожие видео

0 Просмотры

12:13

Секвенирование малых некодирующих РНК от формина-фиксированных тканей и сыворотки полученных экзосом от кастрации устойчивых больных раком предстательной железы

Похожие видео

0 Просмотры

09:40

Протеомический подход на основе масс-спектрометрии для глобального анализа R-метилирования белка с высокой степенью достоверности

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 22 августа 2026