JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 4:50 мин • April 30th, 2023
Фосфорилирование специфических аминокислотных остатков, таких как тирозин, генерирует фосфопептиды, которые играют важную роль в регулировании нескольких клеточных сигнальных путей. Их изучение позволяет выявить потенциальные биомаркеры для терапии рака.
Чтобы выделить фосфопептиды, начните с лиофилизированного порошка очищенных пептидных расщеплений, извлеченных из раковой ткани. Повторно суспендируйте порошок в подходящем буфере, чтобы получить однородную пептидную суспензию. Поддерживайте нейтральный pH для обеспечения стабильности пептидов.
Приготовьте суспензию, состоящую из гидрогелевых шариков, конъюгированных со специфическими антифосфопептидными антителами в нужном буфере. Добавьте суспензию в гранулы пептидной суспензии. Антитела, иммобилизованные на шариках, распознают и связываются со своими специфическими фосфорилированными аминокислотными остатками внутри фосфопептидов, образуя комплексы.
Центрифугой смеси собрать фосфопептидно-шариковые комплексы в гранулы. Удалите надосадочную жидкость, содержащую несвязанные пептиды или неспецифические фосфопептиды. Добавьте в комплексы подходящий буфер для элюирования с низким pH и инкубируйте. Низкий pH ослабляет взаимодействие между остатками фосфопептида и комплексами антитела-гранулы, высвобождая пептиды в раствор.
Переложите смесь в заранее собранный фильтрующий картридж. Центрифуга для вымывания высвобождающихся фосфопептидов в пробирку для сбора. Вакуумная концентрация образца при повышенной температуре, чтобы удалить буфер и получить концентрированную сухую гранулу чистых фосфопептидов.
Ресуспендируйте лиофилизированный порошок с 0,5 миллилитрами ледяного иммунопреципитативного буфера, или IP, связывающего в каждой фракции. Перенесите 0,5 миллилитра объема ресуспензии из второй фракции в пробирку с первой фракцией и сохраните наконечник пипетки. Используйте еще 0,5 миллилитра буфера IP для промывки каждой пробирки лиофилизации перед переносом содержимого в криопробирку. Затем повторите полоскание, используя 2 миллилитра буфера IP.
После использования P200 с разрезанным наконечником для переноса 0,5 миллиграмма на миллилитр суспензии гранул антител в микрофугу пробирки, добавьте 450 микролитров ледяного буфера для связывания IP, чтобы промыть 50 микролитров суспензии гранул антител 4G10 и 25 микролитров суспензии гранул антител 27B10.4 в микрофуге. Центрифугируйте пробирку при температуре 100 x g и 4 градусах Цельсия в течение 1 минуты. После аспирации надосадочной жидкости добавьте равный объем в качестве исходной суспензии буфера для связывания IP для ресуспендирования шариков. Добавьте предварительно промытые шарики pY в раствор ресуспендированного образца в криопробирках с завинчивающейся крышкой. Затем инкубируйте их при температуре 4 градуса Цельсия на ротаторе «конец за концом» на ночь. После закручивания бусин сохраните надосадочную жидкость, которая будет использоваться для обогащения пептидами pST.
Затем используйте 300 микролитров связывающего буфера IP для ресуспендирования шариков и перенесите их в 2-миллилитровую микроцентрифужную пробирку. Уменьшите количество образцов при 100 x g и 4 градусах Цельсия в течение 1 минуты. Затем с 500 микролитрами буфера для связывания IP промойте бусины три раза. Четыре раза промойте шарики 450 микролитрами 25 мМ бикарбоната аммония, pH 7,5. Опустите гелеобразный наконечник немного ниже поверхности шарика и полностью отасуньте надосадочную жидкость. Добавьте к бусинам в четыре раза больший объем швов 0,1% TFA.
Затем хорошо перемешайте их и инкубируйте пробирку в термомиксере при 1000 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Перенесите ресуспензию в спиновой фильтр с давлением 0,2 микрометра и центрифугируйте фильтр при давлении 850 x g в течение 1 минуты. После переноса элюата в микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белка вакуумную концентрацию элюата до сухости при 40 градусах Цельсия с временем нагрева 300 минут в течение ночи.