Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 2:31 мин. • April 30th, 2023
Чтобы начать макродиссекцию, возьмите предметное стекло с тканевым образцом. Кроме того, возьмите предметное стекло с тем же образцом ткани и окрасьте его гематоксилином и эозином для окрашивания H&E.
В нормальных клетках гематоксилин придает нуклеиновым кислотам синий оттенок, в то время как контрокрашивание эозина окрашивает клеточные белки в розовый цвет. Темно-синяя окраска ядра помогает дифференцировать раковые клетки от нормальных.
Наложите окрашенное на H&E предметное стекло на неокрашенное предметное стекло, чтобы выровнять образцы ткани. Найдите часть, содержащую опухолевые клетки, на предметном стекле, окрашенном H&E. Отметьте соответствующую область на незапачканном предметном стекле.
Соскребите нужную ткань с неиспачканного предметного стекла. С помощью влажного наконечника для пипетки соберите соскобленную ткань, чтобы обеспечить легкую передачу образца ткани. Перенесите ткань в трубку, содержащую буфер для лизиса. Компоненты буфера для лизиса переваривают ткань, высвобождая составляющие клетки.
Обработайте лизат подходящей протеазой и инкубируйте при высокой температуре. Протеаза расщепляет загрязняющие ДНКазы, тем самым защищая ДНК от деградации. Храните ДНК, содержащий лизат тканей, для последующего анализа.
Определите раковые ткани опухолевого участка, наиболее подходящие для макродиссекции, в соответствии с соответствующим срезом, окрашенным H&E. Затем макродиспарируйте раковую ткань на основе отмеченного участка. Возьмите чистое лезвие бритвы и аккуратно соскребите раковую ткань со предметного стекла, стараясь сохранить ее в целости и сохранности. С помощью наконечника пипетки перенесите соскобленную ткань в буферный флакон для лизиса.
Повторите этот процесс с остальными слайдами. После того, как вся ткань окажется в трубке, используйте наконечник, чтобы убедиться, что ткань полностью погружена и не прилипла к стене. Добавьте во флакон 20 микролитров сериновой протеазы, связанной с субтилизином, и аккуратно перемешайте. Поместите флакон в термоблок с температурой 55 градусов Цельсия не менее чем на 4 часа или на ночь, следя за тем, чтобы через 2 часа он слегка завихрился.