Бисульфитная конверсия геномной ДНК: метод изучения метилирования ДНК в образцах геномной ДНК из тканей рака желудочно-кишечного тракта

Метилирование ДНК включает в себя добавление метильных групп к цитозиновым остаткам ДНК с образованием метилцитозина, вызывающего изменение ДНК и регуляцию экспрессии генов.

Чтобы изучить метилирование ДНК, начните со взятия сырого экстракта ДНК из раковых клеток. Добавьте буфер для разведения и инкубируйте при комнатной температуре. Буфер разбавляет смесь и денатурирует двухцепочечную ДНК в одноцепочечную ДНК, способствуя доступности оснований для последующих реакций.

Добавьте конверсионный реагент и инкубируйте в темноте. Бисульфит натрия в составе реагента запускает сульфирование и последующее дезаминирование неметилированных остатков цитозина, что приводит к образованию урацил-сульфоната. Однако метилированные остатки цитозина остаются неизменными.

Далее дополните ДНК связывающим буфером и перенесите его в предварительно собранную колонку со спиновым фильтром. Буфер помогает ДНК связываться с фильтром.

Центрифуга для удаления буферной и бисульфитной смеси реагентов из захваченной ДНК в колонке. Откажитесь от проточного потока. Добавьте в ДНК щелочной буфер для десульфирования. Буфер способствует удалению сульфитной группы из урацил-сульфоната с образованием урацила.

Центрифуга для удаления отработанного буфера. Теперь добавьте буфер элюирования в колонку, чтобы элюировать преобразованную ДНК. Проведите ПЦР для амплификации ДНК. Все преобразованные остатки урацила амплифицируются в виде тиминов, в то время как метилированные остатки цитозина амплифицируются в виде цитозинов.

Секвенирование цитозиновых остатков амплифицированной ДНК для получения профиля метилирования образца.

Проведите обработку бисульфитом 45 микролитров переваренной ткани с помощью набора для преобразования бисульфита в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте в образец 5 микролитров разбавляющего буфера и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Тем временем приготовьте реагент для конверсии бисульфита, добавив 750 микролитров дистиллированной воды и 210 микролитров буфера для разбавления в одну пробирку реагента для конверсии КТ. Перемешайте трубки путем вортекса в течение 10 минут. Затем добавьте по 100 микролитров приготовленного реактива для конверсии КТ в каждый образец и перемешайте методом инверсии.

Инкубируйте образцы в темноте при температуре 50 градусов Цельсия в течение 12–16 часов. После инкубации поместите образцы на лед на 10 минут. Добавьте 400 микролитров связующего буфера и перемешайте каждый образец, пипетируя вверх и вниз. Загрузите каждый образец в спиновую колонку и поместите колонку в 2-миллилитровую пробирку для сбора. Центрифугируйте образцы на полной скорости в течение 1 минуты и отбросьте поток. Добавьте 200 микролитров промывочного буфера в каждую колонку и отжимайте на полной скорости в течение 1 минуты, затем выбросьте проточный.

Добавьте 200 микролитров буфера для десульфирования в каждую колонку и дайте колонкам постоять при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации вращайте колонны на полной скорости в течение 1 минуты и отбрасывайте поток. Дважды промойте колонку 200 микролитрами буфера для промывки, центрифугируя в течение 1 минуты на полной скорости после каждой промывки.

Добавьте 46 микролитров дистиллированной воды в каждую колонку и поместите ее в новую стерильную одноразовую полипропиленовую пробирку объемом 1,5 миллитра. Вращайте трубки в течение 2 минут, чтобы вымыть ДНК, и выбросьте колонку. Теперь ДНК готова к анализу. Используйте модифицированную бисульфитом ДНК в качестве матрицы для количественной ПЦР, специфичной для метилирования, чтобы оценить метилирование промоторной области в каждом анализе гена. Объедините реагенты, как описано в текстовой рукописи, и используйте 96-луночный прибор для ПЦР в реальном времени для запуска протокола термоциклирования.