Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 3:20 мин. • April 30th, 2023
Сфероиды представляют собой in vitro культуры клеток, самоагрегируемых с образованием трехмерных сферических структур. Для размножения опухолевых сфероидов начните со сфероидов, культивируемых в подходящем внеклеточном матриксе, или ВКМ, содержащемся в культуральной пластине.
Растирайте с помощью микропипетки, чтобы механически разорвать ЭКМ и разрыхлить сфероиды. Переложите смесь сфероид-ЭХМ в микроцентрифужную пробирку.
Центрифуга на низкой скорости для гранулирования сфероидов и отделения их от ЭХМ в надосадочной жидкости. Выбросьте отработанный ЭХМ-содержащий надосадочную жидкость. Перенесите трубку, содержащую шарик сфероида, на лед, чтобы предотвратить затвердевание ECM на последующих этапах.
Дополните пеллеты свежим сжиженным ЭХМ. Для субкультивирования смешайте содержимое, многократно дозируя вверх и вниз, чтобы диссоциировать сфероидные клетки и выпустить их в суспензию.
Посейте эту смесь, содержащую сфероидобразующие клетки и ВКМ, в чашку для свежей культуры. ЭКМ затвердевает, что позволяет захватывать опухолевые клетки. Добавьте нужную среду для выращивания. Инкубируйте для облегчения роста захваченных клеток в новые сфероиды.
Для транспортировки смесь сфероид-ЭХМ переложите в колбу для культур. Дайте ЭБУ затвердеть и захватите сфероиды внутри.
Наполните колбу питательной средой, чтобы избежать сдвига клеток и сохранить жизнеспособность сфероидов. Переложите колбу в транспортировочную упаковку.
Механически разбейте ЭБУ пипеткой P1000 и перенесите его в стерильную 1,5-миллиметровую трубку. Центрифугируйте пробирку при давлении 1000 x g при температуре 4 градуса Цельсия. Затем удалите всю надосадочную жидкость и поместите трубку на лед. Добавьте в гранулу в два-четыре раза больше объема нового ECM и перемешайте содержимое пробирки, пипетируя вверх и вниз 10 раз, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха.
Перенесите от 5 до 20 микролитров ECM из смеси SBNET на новую 96-луночную пластину и дайте ECM застыть. Затем накройте затвердевший ЭБУ новой средой SBNET и поместите пластину в инкубатор. При отправке сфероидов SBNET в другую лабораторию перенесите сфероиды с новым ECM в колбу T25 и дайте ECM застыть. Наполните колбу сфероидом SBNET, плотно закрутите крышку и подготовьте транспортировочную упаковку.