Покадровая флуоресцентная микроскопия нейтрофильных внеклеточных ловушек или НВЛ: метод анализа постадгезионного взаимодействия между раковыми клетками и НВЛ

Во время патологических состояний, таких как рак, активированные нейтрофилы высвобождают нейтрофильные внеклеточные ловушки или НЭО – сеть волокон внеклеточной ДНК, связанных с гистонами и протеолитическими ферментами. Эти структуры захватывают раковые клетки и играют ключевую роль в метастазировании рака.

Чтобы изучить постадгезионное поведение захваченных раковых клеток в НВЛ in vitro, сначала культивировали нейтрофилы низкой плотности - субпопуляцию нейтрофилов - в чашке для культур, покрытой полимером, которая облегчает прикрепление клеток. Инкубируйте для активации нейтрофилов для высвобождения сетчатых НВЛ.

Затем добавьте непроницаемый для мембраны зеленый флуоресцентный ядерный краситель, чтобы окрашивать волокна ДНК в НВЛ. Удалите отработанное средство. Добавьте в культуру нейтрофилов суспензию раковых клеток.

Инкубируйте культуру в течение короткого периода времени, чтобы облегчить взаимодействие раковых клеток с НВЛ. ДНК-компонент НВЛ функционирует как хемотаксический фактор, который стимулирует миграцию раковых клеток и способствует их адгезии к НВЛ.

Удалите отработанное средство. Аккуратно промойте культуру подходящей свежей средой, чтобы удалить все несвязанные раковые клетки из чашки для культивирования. Пополните запасы свежей сывороткой, содержащей питательную среду.

Визуализируйте культуру в течение длительного времени с помощью покадровой видеомикроскопии для анализа интерактивных событий между НВЛ и раковыми клетками. Со временем НВЛ создают подходящую микросреду, способствующую пролиферации раковых клеток. Используйте подходящее программное обеспечение для наблюдения за пролиферацией раковых клеток на зеленых флуоресцентных НВЛ.

Культивирование и окрашивание перитонеальных нейтрофилов низкой плотности в 35-миллиметровой чашке, покрытой поли-L-лизином, как показано на рисунке, с последующей кратковременной промывкой в 2 миллилитрах 0,1% BSA плюс RPMI 1640.

Замените среду на 1 ум 10 на шестую неокрашенные клетки опухоли желудка, взвешенные в 2 миллилитрах РПМИ с добавлением БСА для 5-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации промойте клетки в 2 миллилитрах свежего RPMI с добавлением BSA в течение 5 минут при комнатной температуре, после чего осторожно взболтайте для удаления любых неприкрепленных опухолевых клеток.

Затем замените надосадочную жидкость на DMEM, дополненную FBS и антибиотиками, и установите чашку в систему наблюдения за клетками полного обзора для покадрового анализа захвата опухолевых клеток НВЛ.