Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 3:43 мин. • April 30th, 2023
Экзосомы — это внеклеточные везикулярные структуры, которые секретируются культивируемыми клетками в надосадочную жидкость. Чтобы приготовить экзосомный блок, начните с приема в пробирку экзосомного супернатанта культуры. Центрифугируйте пробирку на высокой скорости, чтобы гранулировать неповрежденные экзосомы. Выбросьте оставшуюся надосадочную жидкость.
Обработайте гранулу экзосомы глутаральдегидом, присутствующим в фиксирующем буфере. Инкубируйте смесь на льду в течение желаемого времени, чтобы сохранить морфологию экзосом. Глутаральдегид проникает в экзосомы и сшивает белки. Фиксирующий буфер поддерживает нейтральный pH экзосом для последующего процесса фиксации.
Откажитесь от глутаральдегидсодержащего буфера и добавьте раствор тетраоксида осмия - вторичный фиксатор, который пронизывает мембранный бислой и фиксирует липиды, присутствующие в экзосомах. Удалите раствор тетраоксида осмия и обработайте экзосомы рядом увеличивающихся концентраций ацетона. Этот процесс обезвоживает экзосомы.
Замените абсолютный ацетон смесью срединно-ацетоновой среды. Постепенно увеличивайте соотношение заделочной среды в этой смеси.
Разлейте закладочную смесь, содержащую экзосомы, в нужные формы. Высушите формы в духовке при высокой температуре. Это приведет к полимеризации встраиваемой среды вокруг экзосом, что приведет к образованию блоков.
Для закрепления очищенной гранулы экзосомы добавьте 1 миллилитр 2,5% глутаральдегида в 0,1 М раствор какодилата натрия при pH 7,0. Инкубируйте липидные двухслойные везикулы в течение 1 часа при температуре 4 градуса Цельсия. Далее снимите фиксатор и промойте гранулы 1 миллилитром 0,1 М буферного раствора какодилата натрия при комнатной температуре в течение 10 минут.
Затем зафиксируйте образцы 1 миллилитром 2% тетраоксида осмия на 1 час при температуре 4 градуса Цельсия. Снимите фиксатор и трижды промойте гранулу экзосомы с 0,1 М буфером какодилата натрия, меняя буфер каждые 10 минут. Затем обезвожьте образец, встряхивая его в течение 10 минут каждый в серии дифференцированных концентраций ацетона.
Далее смешайте раствор из трех частей ацетона и одной части заделочной смеси с низкой вязкостью. Замените этой смесью ацетон и выдержите образец в течение 30 минут. Продолжайте увеличивать соотношение маловязкой закладочной среды, инкубируя в течение 30 минут с каждым этапом.
Наконец, инкубируйте гранулу экзосомы в 100% смеси для встраивания с низкой вязкостью в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день погрузите образец в чистую смесь для заделки с низкой вязкостью с помощью закладной формы и запекайте его в течение 24 часов при температуре 65 градусов Цельсия.