$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Экзосомы представляют собой небольшие внеклеточные везикулы, содержащие различные биомолекулы, которые служат биомаркерами рака.
Чтобы визуализировать экзосомальные биомаркеры, начните с ультратонких экзосомальных срезов, встроенных в смолу, поддерживаемых подходящими металлическими сетками электронной микроскопии. Инкубируйте сетки в каплях глицина. Глицин связывает и нейтрализует реакционноспособные альдегидные группы в срезах, преодолевая их интерференцию с анализом.
Промойте образец водой, чтобы удалить остатки реагентов. Впоследствии инкубируйте образец в блокирующем буфере. Буфер содержит сывороточные белки, которые блокируют неспецифические сайты связывания антител в образце.
Далее инкубируйте образец в нужном первичном растворе антитела. Эти антитела распознают и связываются со своими мишенями биомаркерами, локализованными в экзосомальном просвете. Смойте все несвязанные антитела подходящим буфером.
Теперь перенесите сетки с образцами в капли, содержащие конъюгированные с золотом вторичные антитела, которые прикрепляются к первичным антителам. Наночастицы золота служат электронно-плотными маркерами для визуализации тонкой локализации молекул-мишеней. Смойте все несвязанные вторичные антитела подходящим буфером.
Наконец, в темных условиях постоянно инкубируйте сетки в растворах уранилацетата и цитрата свинца. Эти реагенты тяжелых металлов окрашивают и усиливают контраст органических молекул, таких как липиды, белки и гликогены, в образце, дифференцируя их от фона.
Рассмотрите окрашенные срезы под просвечивающим электронным микроскопом. Помеченные золотом биомаркеры проявляются в виде темных частиц в просвете экзосомных структур, окрашенных тяжелыми металлами.
Для начала инкубируйте сетки, содержащие неокрашенные срезы толщиной 60 нанометров, в каплях 0,02 М глицина по 50 микролитров в течение 10 минут, чтобы погасить свободные альдегидные группы. Затем промойте срезы в 100 микролитрах дистиллированной воды три раза по 10 минут каждая. После последнего промывки инкубируйте секции в течение 1 часа при комнатной температуре в PBS, содержащем 1% BSA. Затем инкубируйте сетки в каплях от 50 до 100 микролитров антитела против KRS в течение 1 часа.
Далее промойте сетки пять раз по 10 минут каждая в капле PBS, содержащей 0,1% BSA. Затем перенесите в сетки каплю соответствующего вторичного антитела и инкубируйте срезы в течение 1 часа при комнатной температуре. Теперь промойте решетки пять раз в течение 10 минут каждый отдельной каплей PBS, содержащей 0,1% BSA. Дважды окрашивайте срезы 2% уранилацетатом в течение 20 минут в темноте, а затем вводите цитрат свинца Рейнольдса в течение 10 минут. Поместите окрашенный срез в просвечивающий электронный микроскоп и просмотрите образец с помощью напряжения 80 кВ и сделайте его изображение с помощью программного обеспечения микроскопа.