Негативное окрашивание очищенных экзосом: процедура визуализации морфологии экзосом с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Для выполнения негативного окрашивания экзосом - наноразмерных, сферических везикул - начните с взятия подходящей сетки электронной микроскопии. Подготовьте сетку с помощью разрядника накаливания. Этот процесс делает поверхность сетки гидрофильной для лучшей адгезии образцов.

Одновременно берут в пробирку суспензию очищенных экзосом. Дополните пробирку параформальдегидом - фиксатором образца - и инкубируйте. Параформальдегид проникает в экзосомы и сшивает белки и нуклеиновые кислоты. Этот шаг жизненно важен для сохранения морфологии экзосом.

Теперь загрузите суспензию экзосом на заранее подготовленную решетку и инкубируйте, чтобы произошла адсорбция. Далее добавьте несколько капель уранилацетата, красителя тяжелого металла, поверх сетки. Ионы уранила связываются с мембранными белками и липидами, образуя отложения вокруг границы экзосомы.

В последнюю очередь постирайте сетку в воде, чтобы удалить лишнее пятно. Дайте сетке высохнуть и получите изображение с помощью просвечивающей электронной микроскопии или ПЭМ.

Когда электронный луч ударяется об экзосомы, пятно, окружающее образец, рассеивает больше электронов. Экзосомы, будучи менее электронно-плотными, пропускают пучок. Эти по-разному рассеянные электроны захватываются системой визуализации для формирования высококонтрастного изображения.

Отрицательно окрашенные экзосомы выглядят более светлыми, с темной границей вокруг них.

Для того чтобы выполнить негативное окрашивание, после выделения зафиксировать очищенные экзосомы 1 миллилитром 2% параформальдегида в течение 5 минут. Обработайте тонкие медные электромагнитные сетки формвар/углеродной пленкой 200 меш с накаленным слоем в течение 1 минуты. Затем загрузите от 5 до 7 микролитров раствора суспензии экзосомы на решетку и инкубируйте его в течение 1 минуты. Если концентрация экзосомы слишком высока, разбавьте концентрацию до соответствующего уровня.

Немедленно окрасьте экзосомы примерно 20 каплями отфильтрованного 1% раствора уранилацетата на поверхность ЭМ-сетки. Удалите излишки раствора уранилацетата из сетки, соприкоснувшись с краем сетки фильтровальной бумагой. Затем быстро промойте сетку каплей воды.

С помощью пинцета поместите сетку на стол и частично накройте сетку чашкой для культуры. Дайте сетке высохнуть в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем сделайте снимок сетки или сохраните ее в коробке для электронного микроскопа для будущих наблюдений.