Мгновенная заморозка мышечной ткани для разреза: протокол получения ультратонких срезов быстро замороженной мышечной ткани мыши

Мгновенная заморозка — это метод, при котором образцы тканей быстро замораживаются до сверхнизких температур. Он помогает сохранить нативную структуру ДНК, РНК и белков внутри ткани.

Чтобы быстро заморозить мышцу конечности, начните со взятия только что извлеченной мышечной ткани из задней конечности мыши.

Далее возьмите жидкий азот в пенопластовую коробку и погрузите стакан, содержащий изопентан – жидкость с высокой проводимостью – в жидкий азот.

Заморозьте изопентан до тех пор, пока раствор не станет вязким. Одновременно нанесите каплю жидкого замораживающего материала поверх куска пробки.

Расположите мышечную ткань задней конечности, удерживая ее сухожилие, и вертикально вставьте кусочек ткани в жидкую среду для замораживания. Такая ориентация помогает в последующем определении площади поперечного сечения мышцы.

Ненадолго погрузите кусок пробки с прикрепленной мышечной тканью в предварительно охлажденную ванну с изопентаном. Это способствует быстрому и равномерному замораживанию мышечной ткани.

Замораживающая среда застывает при низкой температуре и образует студенистый слой вокруг мышечной ткани, удерживая ее на месте. Поместите мышечный блок в криомикротом, чтобы получить тонко нарезанные срезы.

Поместите срезы на предметные стекла и храните их при более низкой температуре для дальнейшего гистологического анализа.

Когда все мышцы будут собраны, погрузите нижнюю половину пластикового 50-миллилитрового стакана, содержащего изопентан, в жидкий азот. Когда изопентан станет слегка вязким с твердой белой ламинированной подкладкой, видимой внутри стакана, налейте несколько капель закладочной среды на патрон.

Затем возьмите мышцу за сухожилие и осторожно расположите конец свежей мышцы поверх закладной среды, удерживая ее вертикально относительно пробки. Затем, удерживая мышцу вертикально, опустите патрон и прикрепленную мышцу в ванну с изопентаном на 7-15 секунд до полного замерзания ткани. Хорошо замороженный экземпляр будет выглядеть меловым белым. Затем поместите мышцу в пробирку для образцов для немедленного хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Чтобы сохранить РНК, ферментативную структуру и активность образцов, необходимо заморозить мышечные ткани как можно скорее после их экстракции.

Чтобы разрезать замороженную мышечную ткань, сначала установите рабочую температуру внутренней камеры криостата на отрицательные 23 градуса по Цельсию. Дайте образцу с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия акклиматизироваться до рабочей температуры в течение нескольких часов. Затем получите несколько срезов образца толщиной 8 микрон в средней части живота мышцы, перпендикулярно оси крепления, собирая срезы на предметных стеклах комнатной температуры по мере их резки. Храните образцы в криостатной камере до тех пор, пока не будут собраны все срезы. Затем храните образцы при отрицательной температуре 80 градусов Цельсия до дальнейшего анализа.