Выделение мононуклеарных клеток Lamina Propria: метод центрифугирования на основе градиента плотности на основе диоксида кремния для получения мононуклеарных клеток из толстой кишки мышей

Собственная пластинка кишечника, расположенная ниже кишечного эпителия, состоит из рыхлой соединительной ткани вместе с плотной сетью коллагеновых волокон, содержащих разнообразный набор клеток, таких как фибробласты, мононуклеарные клетки, включая лимфоциты и моноциты. Эти клетки играют решающую роль в поддержании гомеостаза.

Чтобы выделить мононуклеарные клетки, начните с взятия фрагментов толстой кишки мыши. Обработайте фрагменты буфером для пищеварения, содержащим ферменты коллагеназы. Ферменты коллагеназы переваривают коллагеновые волокна в тканях, высвобождая клетки в виде суспензии.

Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через клеточные фильтры, чтобы удалить непереваренную ткань и мусор и получить одноклеточную суспензию. Добавьте охлажденный буфер к фильтрату для инактивации ферментов коллагеназы.

Центрифуга для разделения ячеек. Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую ферменты, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в разделительной среде на основе диоксида кремния низкой плотности. Затем нанесите слой суспензии на разделительный материал на основе диоксида кремния высокой плотности, чтобы создать градиент разделения.

Центрифугируйте смесь. Мононуклеарные ячейки оседают и образуют белый слой на границе между слоями градиента плотности. Осторожно переложите белый слой границы раздела в свежую пробирку, содержащую подходящий буфер.

Центрифуга для получения гранулы, содержащей очищенные мононуклеарные ячейки. Повторно суспендируйте окатыш в буфере для дальнейшего анализа по технологической цепочке.

Для начала добавьте 20 миллилитров буфера для расщепления коллагеназы в пробирку, содержащую промытые фрагменты толстой кишки. Запечатайте пробирку и поместите ее в орбитальный шейкер при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью вращения 2 x g на 60 минут. Убедитесь, что фрагменты ткани находятся в постоянном движении во время перемешивания.

Налейте по 5 миллилитров разделительной среды на основе 66% диоксида кремния в каждую из трех отдельных 15-миллилитровых полипропиленовых пробирок. Затем с помощью серологической пипетки объемом 25 миллилитров соберите только надосадочную жидкость из Collagenase Digestion 1. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтрующее сетчатое фильтрующее ячеечное отверстие объемом 40 микролитров, помещенное в чистую полипропиленовую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Полностью заполните пробирку охлажденным толстой кишкой, чтобы погасить буфер для переваривания коллагеназы. Затем вращайте клетки, аспирируйте надосадочную жидкость и держите гранулу на льду.

Продолжайте выполнять Hydratease Digestion 2, как указано в текстовом протоколе. После того, как Collagenase Digestion 2 будет завершено, энергично промойте фрагменты ткани вперед и назад между трубкой и 10-миллилитровым шприцем через тупую иглу 18G. Повторяйте эту промывку не менее семи-восьми проходов, продолжая до тех пор, пока не останутся грубые фрагменты тканей или мусор.

Затем пропустите суспензию для дезагрегации тканей через фильтрующее сетчатое фильтрующее ячеечное фильтрование с 40 микрометрами, помещенное в чистую полипропиленовую трубку объемом 50 миллилитров. Заполните пробирку до края охлажденным толстым буфером, чтобы охладить разложение, и центрифугируйте при 800 x g и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут.

Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумной аспирации и вытяните ресуспендированную гранулу из Collagenase Digestion 1 в соответствующую пробирку. После этого повторно суспендируйте каждую гранулу в 24 миллилитрах 44% разделительной среды на основе диоксида кремния на толстую кишку. С помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров медленно нанесите по 8 миллилитров этой среды на каждую из трех пробирок, содержащих 66% разделительной среды на основе диоксида кремния.

Тщательно отбалансируйте пробирки в ведре центрифуги с помощью весов или весов. Центрифугируйте при температуре 859 x g и при 20 градусах Цельсия в течение 20 минут без перерыва. Перед извлечением трубок дайте роторам полностью отдохнуть, стараясь не нарушить работу ячеек на границе раздела градиента.

Визуализируйте границу раздела градиента рядом с отметкой 5 миллилитров, где обычно присутствует белая полоса толщиной 1-2 миллиметра. Вакуумируйте аспирацию и сбросьте верхние 7 миллилитров градиента, чтобы облегчить доступ пипетки к интерфейсу. Используя непрерывное ручное отсасывание и устойчивые вращательные движения запястья, соберите интерфейсный слой ячеек. Собирайте до тех пор, пока граница раздела между двумя градиентами не станет четкой и преломляемой, и переносите границу раздела в новую 50-миллилитровую полипропиленовую коническую трубку.