Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 3:26 мин. • April 30th, 2023
Чтобы обнаружить определенную последовательность РНК в клетке, начните со взятия среза ткани на предметном стекле. Наложите на участок ткани подходящий буфер для гибридизации, содержащий целевые РНК-зонды.
Эти зонды представляют собой Z-образные молекулы РНК, имеющие участок распознавания мишени на одном конце и последовательность хвоста на другом. Распорный рычаг соединяет эти два конца.
Теперь инкубируйте горло в гибридизационной печи при оптимальной температуре. Z-образные РНК-зонды проникают в клетку и попарно гибридизуются с соответствующей последовательностью мРНК-мишени.
Выньте горку из духовки. Погрузите предметное стекло в моющий раствор, чтобы удалить все несвязанные зонды и излишки буфера для гибридизации.
После этого добавьте раствор предварительного усилителя и инкубируйте. Молекула предусилителя прикрепляется к хвостовой последовательности двух соседних Z-зондов. Эта молекула не связывается с одним Z-зондом, что обеспечивает специфичность.
Далее добавьте в усилитель реагентную смесь и инкубируйте. Несколько молекул амплификатора гибридизуются с одной последовательностью предусилителя.
Наконец, пометьте участок ткани нужными зондами для мечения, чтобы обнаружить присутствие определенной последовательности РНК в клетке.
Чтобы начать гибридизацию, коснитесь и прокрутите предметные стекла, чтобы удалить лишнюю жидкость и поместить их обратно в штатив для слайдов. Достаньте предварительно нагретый зонд ВПЧ из духовки и добавьте примерно четыре капли, чтобы полностью покрыть каждую секцию. Накройте противень крышкой и поставьте его в духовку на 2 часа при температуре 40 градусов Цельсия. После завершения инкубации извлеките противень из духовки и снимите решетку.
По одному слайду за раз, быстро удалите лишнюю жидкость и поместите предметное стекло в решетку для слайдов, погруженную в форму для окрашивания, заполненную буфером для стирки 1x, мойте слайды в течение 2 минут при комнатной температуре с постоянным перемешиванием, и повторите со свежим буфером для стирки 1x. Коснитесь и проведите пальцем, чтобы удалить лишнюю жидкость со слайдов и снова поместить их в решетку для слайдов. Добавьте примерно четыре капли AMP1 комнатной температуры на секцию, чтобы полностью покрыть каждую секцию. Накройте противень крышкой и поставьте его в духовку на 30 минут при температуре 40 градусов Цельсия.
Вынув противень из духовки, снимите решетку. Работая по одному слайду за раз, быстро удалите лишнюю жидкость и поместите предметное стекло в решетку для слайдов, погруженную в форму для окрашивания, заполненную буфером для стирки 1x, простирайте в течение 2 минут при комнатной температуре с постоянным перемешиванием, и повторите со свежим буфером для стирки 1x.