Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 2:42 мин. • April 30th, 2023
Чтобы обнаружить хромогенные сигналы во время РНК-гибридизации, начните со взятия среза ткани на предметном стекле. Этот раздел содержит целевую РНК, предварительно гибридизованную с зондом РНК, меченным пероксидазой хрена.
Нанесите несколько капель диаминобензидина или DAB, субстрата для обнаружения, на участок ткани и инкубируйте.
DAB проникает в клетку, и фермент пероксидаза хрена окисляет ее с образованием коричневого осадка. Эта реакция придает коричневый цвет определенным последовательностям РНК в клетке. Клетки, которые не содержат целевой РНК, не будут иметь пероксидазной активности и останутся неокрашенными.
Далее запятнайте участок ткани гематоксилином. Гематоксилин связывается с ДНК и придает участок ткани фиолетовый оттенок.
Обработайте участок ткани аммиачной водой – раствором для воронения. Он снижает интенсивность фиолетового пятна, заставляя клетки казаться синими. Этот шаг необходим для четкой визуализации коричневых пятен внутри клеток.
Теперь погрузите участок ткани во все возрастающие концентрации этанола и впоследствии обработайте его ксилолом – органическим растворителем. Эти шаги обезвоживают участок ткани для получения более качественных изображений.
Наконец, запечатайте предметное стекло с помощью монтажного раствора и покровного стекла и визуализируйте под световым микроскопом. Клетки демонстрируют точечные коричневые точки, указывающие на наличие целевой РНК.
Диспонируйте одинаковое количество капель каждого раствора DAB-A и DAB-B в пробирке соответствующего размера, чтобы получить примерно 120 микролитров субстрата DAB на секцию и вихрь. Возьмите каждый слайд по одному со стойки для слайдов, коснитесь и пролистайте, чтобы удалить лишнюю жидкость, и поместите его обратно в штатив для слайдов. Нанесите пипеткой примерно 120 микролитров смеси DAB на каждый срез ткани, убедившись, что срезы покрыты. Выдержать в течение 10 минут при комнатной температуре и приступить к противостоящему окрашиванию.
Поместите одну каплю монтажного материала на стеклянную планку, а затем поместите планку на предметные стекла и дайте им высохнуть на воздухе. Через несколько часов приступайте к оценке с помощью оптического микроскопа, как описано в рукописи.