Встраивание 3D-сфероидов в капли агарозного геля: метод сохранения сфероидов для последующего анализа

Сфероиды представляют собой трехмерные сферические клеточные агрегаты in vitro, которые имитируют микроокружение опухоли in vivo и помогают изучать опухолевую прогрессию. Чтобы сохранить эти сфероиды путем встраивания, начните с взятия стерильной пробирки, содержащей сфероиды в желаемом буфере.

Обработайте сфероиды параформальдегидом. Параформальдегид сшивает клеточные белки, что приводит к стабилизации и сохранению клеточной структуры. Центрифугируйте сфероиды и удалите пароформальдегидсодержащую надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте сфероидную гранулу в буфере.

Далее приготовьте нужную концентрацию раствора расплавленного агарозного геля. Сделайте каплю агарозного геля на предметное стекло микроскопа. Держите предметное стекло на нагревательном блоке, чтобы избежать застывания агарозы.

С помощью микропипетки с широким наконечником отверстия соберите сфероиды из пробирки. Осторожно введите сфероиды в центр агарозной гелевой капли, не касаясь предметного стекла микроскопа. Затем инкубируйте предметное стекло при подходящей температуре, чтобы позволить ЭХМ затвердеть и захватить сфероиды внутри.

Аккуратно переложите полутвердую каплю со предметного стекла микроскопа в тканевую кассету. Храните встроенные сфероиды в этаноле до дальнейшего анализа.

Для начала закрепите сфероиды в вытяжном шкафу в первый день, как указано в текстовом протоколе. На второй день поместите агарозный гель в наполненный водой стакан в микроволновой печи, чтобы нагреть его, и держите гель в тепле на настольной нагревательной пластине, установленной на 60 градусов Цельсия, пока он не понадобится.

Дважды промойте сфероиды в вытяжном шкафу, используя 1 миллилитр ледяного 1X PBS за одну стирку. Затем аспирируйте большую часть PBS. Приготовьте наконечник для пипетки объемом 20 микролитров, разрезав его под наклоном, чтобы получить более заостренный наконечник с большим отверстием.

После этого сделайте каплю агарозного геля на предметное стекло микроскопа. Поместите предметное стекло на теплый нагревательный блок, чтобы агароза не застыла. С помощью модифицированного наконечника пипетки улавливайте как можно больше сфероидов в объеме от 15 до 20 микролитров.

Осторожно введите сфероиды в центр капли агарозного геля, следя за тем, чтобы не касаться предметного стекла микроскопа. Инкубируйте при комнатной температуре или при температуре 4 градуса в течение 5-10 минут, чтобы капля агарозного геля застыла. Когда капля геля немного застынет, но все еще будет довольно мягкой, с помощью скальпеля осторожно вытолкните ее из предметного стекла микроскопа в пластиковую тканевую кассету. Перенесите тканевую кассету в стакан, наполненный этанолом, и храните при комнатной температуре.