$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Микроносители представляют собой сферические опорные матрицы микронного размера с соединенными между собой порами, которые обеспечивают обширную поверхность для прикрепления и роста клеток.
Чтобы получить внеклеточный матрикс или микроносители, полученные из ВКМ, начните с однородной суспензии мелко порошкообразной ВКМ. Загрузите суспензию в шприц, подключенный к инфузионному набору. Закрепите шприц на шприцевом насосе. Расположите иглу вертикально над криогенной колбой на соответствующем расстоянии.
Теперь подключите иглу к положительной клемме высоковольтного источника питания. Прикрепите сложенную полоску из алюминиевой фольги к краю колбы и подключите ее к клемме заземления, чтобы замкнуть цепь.
Далее залейте жидкий азот в колбу с погруженным в воду внутренним концом алюминиевой полосы. Подайте желаемое напряжение и установите шприцевой насос на подходящую скорость потока, чтобы начать электрораспыление. По мере того, как проводящая суспензия ЭХМ выходит из кончика иглы, ее форма деформируется под воздействием электрического поля и поверхностного натяжения, образуя заостренный конус жидкости.
С приращением напряжения суспензия вырывается наружу. В конечном итоге он разбивается на заряженные более мелкие капли и попадает в ванну с жидким азотом. Жидкий азот мгновенно замораживает микрокапли, кристаллизуя частицы растворителя внутри.
Переложите замороженные микрокапли в свежую пробирку. Лиофилизируйте образец. Этот этап помогает удалить из образца замерзшие частицы растворителя, образуя на их месте поры. Храните сухой порошок пористых микроносителей для дальнейшего применения.
Инкубируйте криофрезерованную суспензию ECM с непрерывным перемешиванием при 100 об/мин в течение ночи. Загрузите 3 миллилитра суспензии ECM в 3-миллилитровый шприц Luer-Lock и прикрепите к отверстию шприца крылатый инфузионный набор. Закрепите шприц внутри шприцевого насоса. Затем закрепите иглу на ретортной подставке и расположите кончик иглы вертикально на расстоянии от 4 до 6 сантиметров от верхней части низкопробной колбы Дьюара.
Затем прикрепите электрод с зажимом типа «крокодилизатор» к кончику иглы, также убедившись, что зажим из кожи аллигатора подключен к положительной клемме высоковольтного источника питания. Сложите полоску алюминиевой фольги над краем вакуумной колбы. Затем прикрепите второй электрод из кожи аллигатора к внешнему краю фольги. Подключите его к клемме источника заземления блока питания.
Наполните колбу Дьюара жидким азотом примерно на 1 сантиметр от верха так, чтобы три четверти фольги было погружено в воду. Затем установите шприцевой насос на скорость инфузии 30 миллилитров в час и распылите образцы электроспреем в соответствии с текстовым протоколом. Как только инфузия будет завершена, осторожно слейте лишний жидкий азот из сосуда Дьюара, оставив микроноситель взвешенным примерно в 25 миллилитрах жидкого азота, чтобы они оставались замороженными.
Немедленно переложите микроносители с жидким азотом в 50-миллилитровую центрифужную пробирку, заливая одним плавным движением. Затем с помощью совки соберите все замороженные микроносители, оставшиеся в Дьюаре. Добавьте их в пробирку центрифуги. Чтобы подготовиться к лиофилизации, накройте центрифужную пробирку алюминиевой фольгой, перфорированной с небольшими отверстиями. Поместите закрытые центрифужные пробирки в колбу для лиофилизатора. Затем сразу же подключите колбу к лиофилизатору и просушите образцы в течение ночи.