Создание трехмерной ко-культурной модели ганглиев дорсальных корешков мыши и раковых клеток: модель in vitro для изучения периневральной инвазии раковых клеток

Периневральная инвазия или ПНИ относится к миграции раковых клеток по нервам и их последующему вторжению в периневрию – подходящую микросреду для роста рака и метастазирования.

Чтобы имитировать PNI in vitro, начните с добавления капли внеклеточного матрикса или суспензии ECM на чашку для культуры таким образом, чтобы она приняла форму полусферы. Теперь инкубируйте чашку для культивирования, чтобы усилить структурные и функциональные особенности 3D-каркаса.

Затем осторожно поместите предварительно собранный ганглий дорсального корешка или DRG, скопление сенсорных нейронов, в центр полутвердой капли ECM. Инкубируйте для встраивания DRG в каплю ECM.

После этого добавьте подходящую питательную среду и инкубируйте. Обогащенная питательными веществами ЭКМ способствует прорастанию DRG в небольшие нервные выступы, называемые нейритами, которые разрастаются радиально по направлению к окружности капли.

Удалите отработанную среду, чтобы подготовить каплю ECM для последующего анализа. Семена флуоресцентно окрашивают прилипшими раковыми клетками над каплей. Из-за полусферической формы раковые клетки перекатываются и расселяются по периферии капель.

Инкубируйте чашку для культивирования, чтобы обеспечить взаимодействие раковых клеток и нейритов. При рассмотрении под флуоресцентным микроскопом можно увидеть, как раковые клетки следуют вдоль нейритов и мигрируют в сторону DRG, подтверждая периневральную инвазию.

Для приготовления капель полутвердой матрицы необходимо перенести одну стеклянную пластину с дном льда на ледяную глыбу под операционным микроскопом. Поместите наконечник пипетки объемом не более 10 микролитров непосредственно на стекло под углом 45 градусов и осторожно нанесите каплю матрицы объемом 1,5 микролитра на стекло. Медленно отодвиньте наконечник пипетки от стекла по мере того, как матрица войдет в зацепление с пластиной.

Нанесите по одной капельке матрицы на каждый из четырех углов пластины и перенесите пластину на поверхность с комнатной температурой примерно на 1 минуту. Когда матрица немного напряглась, верните пластину в ледяную глыбу и с помощью закрытых микроскопических щипцов аккуратно зачерпните ДРГ левой рукой.

Правой рукой осторожно перенесите нервную ткань на кончик иглы 21G и с помощью иглы аккуратно введите DRG в середину капли матрицы. DRG должна легко вдаваться в матрицу для центрального позиционирования с помощью иглы.

Вставив кусочек DRG в каждую из четырех капель, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 3 минуты. Когда все DRG будут встроены, держите пластины по одной под небольшим углом и медленно добавляйте 4 миллилитра DMEM с добавлением 10% FBS к пластинам так, чтобы среда только постепенно соприкасалась с матричными блоками DRG.

Верните тарелки в инкубатор еще на 48 – 72 часа. Когда невриты достигнут не менее 75% пути к краю матрицы, отсасывайте среду из скважин, не снимая матрицы-блоки DRG. Затем с помощью 200-микролитровой пипетки с плавным триггером поместите две капли 3 раза по 10 до пятой клетки на миллилитр среды над каждой матрицей DRG анализа и верните планшеты в инкубатор. Через час аккуратно добавьте 4 миллилитра DMEM с 10% FBS вдоль боковой стенки стеклянной нижней пластины и верните пластины в инкубатор до их следующей микроскопической оценки.