Анализ популяционной дискриминации рака: метод выделения раковых стволовых клеток с помощью анализа на отток красителя Хёхста

Опухоль содержит небольшую часть стволовых клеток, известную как побочная популяция. Эти клетки устойчивы к химиотерапии, что делает их ответственными за рецидив рака.

Чтобы изолировать побочную популяцию раковых клеток, начните с добавления раствора флуоресцентного красителя Хёхста во флакон, содержащий суспензию раковых клеток. Внутри нормальных раковых клеток молекулы Хёхста проникают в ядро и связываются с богатой A-T областью ДНК, что приводит к высокой флуоресценции в этих клетках.

В противоположность этому, боковая популяция содержит высокую концентрацию транспортеров ABC - эффлюксных насосов, которые быстро удаляют молекулы красителя из клетки. Этот активный отток молекул красителя заставляет боковую популяцию флуоресцировать с низкой интенсивностью.

Теперь возьмите еще один флакон с раковыми клетками, обработанными Хёхстом, и добавьте в него Верапамил. Этот флакон действует как контроль, так как Верапамил блокирует транспортеры ABC. Этот этап приводит к уменьшению оттока Хёхста и сохранению красителя внутри боковых популяционных клеток.

Затем закрасьте клетки в обоих флаконах с помощью йодида пропидия. Йодид пропидиума проникает исключительно в ядро мертвых клеток и интеркалируется между основаниями ДНК. Это приводит к высокой флуоресценции в мертвых клетках.

Наконец, отсортируйте клетки с помощью флуоресцентно-активируемого сортировщика клеток или FACS. FACS отделяет высокофлуоресцентные, сохраняющие Хёхста опухолевые клетки и мертвые клетки от низкофлуоресцентных побочных популяционных клеток.

Чтобы выбрать побочную популяцию раковых стволовых клеток с помощью анализа оттока красителя Хёхста, сначала пометьте одну коническую пробирку «Хёхст» и одну «Хёхст и Верапамил». Затем промойте культуру клеток HNSCC стерильным PBS с последующим добавлением 1 миллилитра трипсина-ЭДТА. Через 3 минуты при 37 градусах Цельсия остановите реакцию со свежей средой для культивирования клеток и подсчитайте клетки. Разведите культуру в соотношении 1 ум 10 до седьмой клетки на миллилитр в полной среде родительской клеточной линии.

Затем добавьте 100 микролитров в пробирку «Hoechst and Verapamil» и 4 миллилитра клеток в пробирку «Hoechst». Затем аккуратно смешайте 10 микролитров 5 миллимолярного раствора верапамила гидрохлорида с образцом «Хёхст и Верапамил», а затем 5 мкст Хёхста из расчета 1 умножить на 10 до шестой клетки в обе пробирки. Затем накройте образцы алюминиевой фольгой и поместите их при температуре 37 градусов Цельсия. Через 90 минут с аккуратным перемешиванием каждые 15 минут центрифугируйте пробирки и повторно суспендируйте гранулы в 2 миллилитрах PBS.

После повторного центрифугирования суспендируйте гранулу «Hoechst and Verapamil» в 500 микролитрах йодида пропидия в PBS и гранулу «Hoechst» в 4 миллилитрах того же дозатора. Теперь отфильтруйте образцы через 70-микронные сетчатые фильтры в пробирки FACS, чтобы удалить любые заполнители и поместить образцы на лед, защищенный от света. Затем загрузите образец «Hoechst» на проточный цитометр и откройте окно «Global Worksheet» в программном обеспечении проточного цитометра. Нажмите на кнопку "Точечная диаграмма", чтобы создать график на глобальном листе, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать параметры прямого и бокового рассеяния.

Таким же образом создайте точечную диаграмму бокового разброса в ширину по высоте бокового разброса, а затем нажмите "Polygon Gate", чтобы создать область P1 на втором графике, чтобы выбрать отдельные ячейки и различить дублеты. Затем создайте красную область Хёхста с помощью синей точечной диаграммы и щелкните правой кнопкой мыши по ячейкам, чтобы выделить популяцию P1. Затем создайте область P2 для выбора отрицательной популяции клеток с помощью красителя Хёхста, которая отображается как боковое оружие слева от основной популяции клеток, и соберите 10 000 событий выборки Хёхста.

Чтобы убедиться, что вентиль P2, представляющий боковую популяцию, расположен правильно, соберите также 10 000 событий выборки «Хёхст и Верапамил». Популяция побочного населения должна исчезнуть. Затем отсортируйте побочную популяцию отрицательных красителей Хёхста в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую 1 миллилитр полной среды раковых стволовых клеток. В конце сортировки раскрутите клетки вниз и ресуспендируйте побочную популяционную гранулу в 1 миллилитре свежей полной раковой стволовой клеточной среды. Затем подсчитайте клетки и засейте их в нужном количестве в новую колбу для клеточных культур.