Экстракция экзосом на основе магнитных шариков: метод выделения специфических экзосом из биожидкостей

Экзосомы представляют собой внеклеточные везикулярные структуры, секретируемые клетками в биожидкости. Чтобы захватить определенные экзосомы из биожидкостей, начните с взятия магнитных шариков, покрытых стрептавидином, в пробирку.

В эту пробирку добавьте биотинилированные антитела к человеку. Биотин, присутствующий в антителах, обладает высоким сродством к стрептавидину, присутствующему в магнитных шариках. Это приводит к конъюгации антител с магнитными шариками.

Затем добавьте богатый белком блокирующий раствор в пробирку, содержащую магнитные шарики, меченные антителами. Белки в блокирующем растворе связываются со свободными участками на магнитных шариках и повышают специфичность связывания экзосом.

Теперь дополните пробирку образцом биожидкости, богатой экзосомами. Инкубируйте трубку с перемешиванием. Экзосомы в биожидкости демонстрируют специфические поверхностные рецепторы, которые помогают им связываться с антителами, прикрепленными к поверхности магнитных шариков.

Далее поместите трубку в магнитное поле. Под воздействием магнитного поля связанные с экзосомами магнитные шарики прикрепляются к поверхности трубки. Затем с помощью микропипетки отсасывают остатки биожидкости из пробирки.

Наконец, извлеките трубку из магнитного поля и добавьте подходящий буфер для элюирования связанных с экзосомами шариков. Эти связанные с экзосомами бусины могут быть использованы для дальнейшего анализа.

Суспендируйте исходный раствор, содержащий 10 микрограммов на миллилитр магнитных микрочастиц, покрытых стрептавидином, и добавьте 5 микролитров раствора в микроцентрифужную пробирку, содержащую 495 микролитров PBS. Чтобы промыть бусины, сначала установите трубку на магнитную решетку на 1 минуту и аккуратно снимите буфер, не потревожив бусины.

Затем переложите трубку на немагнитный штатив. Добавьте 500 микролитров PBS и пипеткой для промывки шариков. Проделайте это в общей сложности три раза. После окончательной промывки повторно суспендируйте шарики в 490 микролитрах PBS, а затем добавьте 5 микролитров биотинилированного антитела мыши к человеческому CD63 из расчета 1 миллиграмм на миллилитр исходного раствора.

Перемешайте раствор с помощью пипетирования. Запрограммируйте вращатель образца на возвратно-поступательное вращение на 90 градусов в течение 5 секунд и вибрацию на 5 градусов в течение 1 секунды. Поместите трубки во вращатель и запустите программу в течение 30 минут при комнатной температуре.

Далее перенесите трубки на магнитный штатив на 5 минут. Промойте бусины три раза 500 микролитрами PBS, а затем повторно суспендируйте их в 490 микролитрах PBS, содержащем казеин. Пометьте пробирку с указанием идентификации образца, а затем добавьте 10 микролитров образца.

Пипеткой несколько раз смешать образец с конъюгированными с антителами шариками. Далее перенесите пробирки в ротатор образца и запустите ту же программу в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем трижды промойте шарики 500 микролитрами 1М трис-гидрохлоридного буфера с помощью намагниченного штатива. Теперь экзосомы связаны с намагниченными бусинами.