Культивирование салисфер из ткани слюнных желез: метод получения салисфер из эпителиальных клеток, полученных из слюнных желез человека

Салисферы представляют собой in vitro, самоагрегирующие культуры эпителиальных клеток, полученные из слюнной железы. Чтобы культивировать салисферы, начните со взятия ткани слюнных желез человека в культуральную тарелку.

С помощью ножниц измельчите ткань на мелкие кусочки. Затем дополните эти кусочки раствором диссоциации, содержащим коллагеназу и ферменты и инкубируйте. Эти ферменты переваривают внеклеточный матрикс, присутствующий в ткани.

Далее растираем для гомогенизации ткани. На этом этапе эпителиальные клетки и эритроциты высвобождаются в раствор. Затем используйте клеточный фильтр и отфильтруйте гомогенат ткани в свежую коническую трубку, чтобы удалить непереваренные кусочки ткани и мусор. Центрифуга для гранулирования ячеек.

После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере для лизиса эритроцитов. Этот буфер разрывает эритроциты, присутствующие в клеточной суспензии.

Теперь центрифуга для гранулирования эпителиальных клеток. Ресуспендируйте гранулу в соответствующую среду для роста эпителиальных клеток. Кроме того, подготовьте планшет для культивирования салисферы, покрыв его лункой матрицей с жидкой базальной мембраной или BMM. Инкубируйте, чтобы матрица затвердела.

Наконец, добавьте суспензию эпителиальных клеток в лунки, покрытые BMM. В присутствии питательной среды эпителиальные клетки прикрепляются к слою BMM и пролиферируют в сферические салисферы.

В течение двух-четырех часов после извлечения у пациента на культуральной тарелке с помощью стерилизованных ножниц и хирургических щипцов измельчите ткань слюнной железы на мелкие кусочки размером от 1 до 2 миллиметров. Добавьте 6 миллилитров раствора диспазы/коллагеназы в измельченную салфетку. Затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно от 30 минут до одного часа.

Нарушьте работу тканей путем пипетирования с помощью серологической пипетки объемом 5 миллилитров от 15 до 20 раз. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия еще от 30 минут до одного часа. Повторите пипетирование и этап инкубации еще два-три раза или до тех пор, пока ткань не станет похожа на кашицу и не сможет легко пройти через отверстие пипетки.

Чтобы покрыть лунки BMM, медленно пипетируйте 500 микролитров размороженного за ночь BMM в каждую лунку 6-луночного планшета. Медленно поворачивайте пластину, чтобы равномерно распределить BMM по лункам. Затем инкубируйте пластины с покрытием при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 15 минут перед использованием, чтобы BIM затвердел.

Перенесите раствор диспазы/коллагеназы, содержащий гомогенизированную ткань, в 15-миллиметровую коническую трубку. Один раз промойте стенку пластины 6 миллилитрами DPBS, чтобы перенести оставшиеся клетки в коническую трубку. Затем через 70-микрометровое сетчатое сетчатое фильтр отфильтруйте гомогенат в новую 50-миллиметровую коническую трубку, чтобы удалить непереваренную ткань.

Центрифугой процеживают клетки в течение 5 минут при 500 х г. Отсасывайте надосадочную жидкость. Затем ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах 1x буфера для лизиса эритроцитов. Выдерживать 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте от 20 до 25 миллиметров DPBS, чтобы нейтрализовать буфер для лизиса эритроцитов и свести к минимуму лизис клеток слюны.

Центрифугируйте в течение 5 минут при 500 х г. Гранула лейкоцитов указывает на полный лизис всех эритроцитов. Если гранула имеет красный цвет, повторите обработку буфером для лизиса эритроцитов. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1-2 миллилитрах BEGM, а затем перенесите ресуспендированные клетки в лунки с покрытием BMM.

Инкубировать при температуре 37 градусов по Цельсию. После нанесения на BMM клетки формируются в сферические структуры или салисферы в течение двух-трех дней. Клетки могут сохраняться в виде салисфер в течение примерно пяти-семи дней, прежде чем BMM начнет разлагаться, позволяя клеткам получать доступ к пластику и прилипать к нему и расти в виде монослоя.