Модель глиомы, меченной люциферазой: опосредованный лентивирусом метод получения стволовых клеток глиомы, меченных люциферазой, для терапевтических исследований in vitro

Стволовые клетки глиомы или ГСК являются субпопуляцией глиомы – рака глиальных клеток в головном мозге.

Маркировка этих GSC биолюминесцентными ферментами, такими как люцифераза, помогает проводить высокопроизводительные визуализирующие анализы для скрининга лекарственных препаратов.

Чтобы получить меченые люциферазой ГСК, начните с культивирования ГСК в подходящей питательной среде.

Центрифугируйте культуру для получения клеточной гранулы и удалите надосадочную жидкость.

Добавьте в гранулу подходящие пищеварительные ферменты. Эти ферменты диссоциируют клеточные кластеры и разрушают любые следы соединительной ткани с получением одноклеточной суспензии.

Теперь центрифугируйте одноклеточную суспензию и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в свежей среде.

Далее засейте семена нужной концентрации клеток в культуральной тарелке.

Инкубируйте культуру и дайте клеткам прилипнуть к планшету с культурой.

Затем добавьте желаемый титр вируссодержащей генной конструкции для зеленого флуоресцентного белка, усиленного люциферазой, или EGFP, и инкубируйте.

Вирус взаимодействует с поверхностными рецепторами ГСК, вызывая высвобождение вирусной РНК, содержащей люциферазу-EGFP. Клеточные ферменты катализируют обратную транскрипцию РНК в двухцепочечную ДНК и интегрируют ее в геном ГСК.

При визуализации под флуоресцентным микроскопом клетки, экспрессирующие люциферазу, кажутся зелеными из-за флуоресценции, излучаемой EGFP.

Начните со сбора стволовых клеток глиомы или ГСК из питательной среды и центрифугирования их при 70 x g в течение 3 минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости переваривают клетки с аккутазой в течение 4 минут при 37 градусах Цельсия.

С помощью наконечника объемом 200 микролитров несколько раз пипетируйте клетки, чтобы диссоциировать и повторно суспендировать клеточную гранулу. Добавьте GSC с плотностью 200 000 клеток в 1 миллилитр питательной среды в каждую лунку 12-луночного планшета и инкубируйте их в течение ночи.

На следующий день добавьте по 30 микролитров надосадочной жидкости вируса люциферазы-EGFP в каждую лунку планшета. Центрифугируйте клетки при давлении 1000 x g в течение 2 часов при температуре 25 градусов Цельсия и инкубируйте их в течение ночи.

На следующий день замените среду в лунках, собрав ГСК, центрифугируя их, удалив надосадочную жидкость, повторно суспензируя в свежей среде и снова погасив их. Культивируйте клетки еще 48 часов.

Понаблюдайте за планшетом под флуоресцентным микроскопом и подтвердите появление GFP-положительных клеток.