$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Клеточная биолюминесценция является высокочувствительным и быстрым подходом к широкомасштабному скринингу противораковых препаратов.
В этой методике используются опухолевые клетки, экспрессирующие люциферазу – фермент, который катализирует светопроизводящую химическую реакцию, заставляя клетки-хозяева светиться в темноте. Интенсивность излучаемой люминесценции прямо пропорциональна плотности живых клеток.
Для начала засейте клетки, экспрессирующие люциферазу, в оптически прозрачной культуральной пластине, покрытой внеклеточным матриксом или ВКМ, и инкубируйте.
Во время инкубации ВКМ хорошо способствует прикреплению клеток к культуре.
Далее берут концентрированные запасы лекарственной комбинации и добавляют разные объемы питательных сред для приготовления серийного разведения лекарственной смеси.
Теперь удалите питательную среду из прилипших клеток. Добавляйте разные разведения лекарственной комбинации и инкубируйте.
Во время инкубации комбинация препаратов действует синергетически на клеточные мишени.
Теперь удалите содержащую лекарство среду и добавьте свежую среду, содержащую люциферин.
Люциферин диффундирует по мембране и проникает в клетки. Люциферазы, экспрессируемые клетками, используют клеточную АТФ для окисления люциферина и излучения световых сигналов.
Количественно оцените клеточную биолюминесценцию с помощью системы визуализации.
Снижение светового излучения при увеличении концентрации препарата свидетельствует о снижении жизнеспособности клеток. Это коррелирует с антипролиферативным действием препарата на клетки-мишени.
Смажьте 96-луночные оптические донные пластины смесью внеклеточного матрикса типа Матригель и инкубируйте их в течение 1 часа при температуре 37 градусов Цельсия. Удалите излишки смеси и аккуратно промойте пластины с помощью PBS.
Затем посейте клетки XG387-Luc с плотностью 1000 клеток в 100 микролитров питательной среды в каждую лунку покрытых покрытием планшетов и культивируйте их в течение ночи. На следующий день понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить их прикрепление к пластине.
Далее готовят 200-микролярный раствор темозоломида и 2-микромолярные растворы целевых агентов в культуральной среде. Для скрининга комбинированного лекарственного средства удаляют пустую среду и добавляют среду, содержащую либо 200-микромольный темозоломид, либо 2-микромолярный таргетный агент, либо комбинацию того и другого, в каждую лунку для 3 технических повторов за одну обработку.
Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе в течение 3 дней. Получение изображений клеточной биолюминесценции в пластине с помощью системы визуализации спектра IVIS. Используя встроенное программное обеспечение, создайте несколько круговых областей интересующей области и количественно оцените клеточную биолюминесценцию.