Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 3:22 мин. • April 30th, 2023
Для начала возьмите пробирку, содержащую неповрежденные внеклеточные везикулы или ВВ.
Суспендируйте EV в нужном объеме буфера для лизиса и произведите ультразвуковую обработку образца. Эта обработка лизирует мембрану EV и срезает генетический материал, высвобождая белки в буфер.
Центрифуга для гранулирования клеточного мусора и срезанного генетического материала. Соберите надосадочную жидкость, содержащую различные белки.
Добавьте в экстракт белка загрузочный краситель и нанесите его на гель SDS-PAGE.
Замочите гель в растворе для окрашивания, чтобы молекулы красителя могли связать белки. Найдите испачканную ленту, содержащую нужный белок, и вырежьте ее.
Разрежьте цветную ленту на небольшие кусочки, чтобы улучшить доступность белков к ферментам на последующих этапах. Переложите эти кусочки в микроцентрифужную пробирку.
Добавьте раствор, который удаляет окрашивающий краситель. Удалите отработанный раствор для задержания.
Добавьте восстановительный раствор. Инкубируйте, чтобы восстановитель мог расщепить дисульфидные связи в белке, обнажая свободные сульфгидрильные группы.
Обработайте восстановленные белки алкилирующим раствором. Алкильные группы связываются со свободными сульфгидрильными группами, поддерживая белок в развернутом состоянии.
Слейте излишки раствора и промойте кусочки обезвоживающим раствором, чтобы удалить алкилирующий реагент. Высушите гель полностью.
Теперь кусочки геля готовы для дальнейшего протеомного анализа.
Для экстракции белка смешайте 50 микролитров буфера RIPA с образцом EV в течение 5 минут со льдом. Облучите образец ультразвуком три раза при мощности 500 Вт и 20 килогерц в течение 5 секунд. Затем удалите везикулярный мусор центрифугированием при температуре 20 000 x g в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия.
После выделения белков выполните миграцию белков в стекирующем геле 12% полиакриламидного геля. Закрепите белки в геле с помощью Coomassie blue на 20 минут при комнатной температуре. Затем вырежьте каждый цветной кусочек геля и нарежьте его небольшими кусочками.
Проведите кусочки геля через серию последовательных промывок, как описано в рукописи. Затем полностью высушите их с помощью вакуумного концентратора. После сушки проведите восстановление белка 100 микролитрами 100-миллимолярного бикарбоната аммония, содержащего 10-миллимолярный дитиотреит, в течение 1 часа при температуре 56 градусов Цельсия.
Далее проводят алкилирование белка 100 микролитрами 100-миллимолярного бикарбоната аммония, содержащего 50-миллимолярный йодоацетамид, в течение 45 минут в темноте. Промойте кусочки геля в соответствии с инструкциями рукописи и полностью высушите их на вакуумном концентраторе.