SDS-PAGE Экстракция белков, ассоциированных с внеклеточными везикулами: процедура извлечения белков из ВВ и подготовки их к перевариванию в геле

Для начала возьмите пробирку, содержащую неповрежденные внеклеточные везикулы или ВВ.

Суспендируйте EV в нужном объеме буфера для лизиса и произведите ультразвуковую обработку образца. Эта обработка лизирует мембрану EV и срезает генетический материал, высвобождая белки в буфер.

Центрифуга для гранулирования клеточного мусора и срезанного генетического материала. Соберите надосадочную жидкость, содержащую различные белки.

Добавьте в экстракт белка загрузочный краситель и нанесите его на гель SDS-PAGE.

Замочите гель в растворе для окрашивания, чтобы молекулы красителя могли связать белки. Найдите испачканную ленту, содержащую нужный белок, и вырежьте ее.

Разрежьте цветную ленту на небольшие кусочки, чтобы улучшить доступность белков к ферментам на последующих этапах. Переложите эти кусочки в микроцентрифужную пробирку.

Добавьте раствор, который удаляет окрашивающий краситель. Удалите отработанный раствор для задержания.

Добавьте восстановительный раствор. Инкубируйте, чтобы восстановитель мог расщепить дисульфидные связи в белке, обнажая свободные сульфгидрильные группы.

Обработайте восстановленные белки алкилирующим раствором. Алкильные группы связываются со свободными сульфгидриль