Прижизненная визуализация на основе черепных окон на мышиной модели: метод визуализации для изучения поведения предварительно введенных раковых клеток в мозге мышиной модели

Прижизненная визуализация через оптические окна позволяет отслеживать отдельные клетки с высоким разрешением для изучения их поведения в естественной микросреде у живого животного.

Для начала возьмем мышь под наркозом, в мозг которой предварительно введены раковые клетки, а имплантированное черепное окно помещается в металлическое кольцо. Раковые клетки экспрессируют ядерные флуоресцентные белки.

Поместите мышь лицевой стороной вверх в поле визуализации. Магнитный держатель в коробке для визуализации помогает закрепить имплантированное черепное окно.

Теперь перенесите коробку визуализации внутрь камеры визуализации инвертированного микроскопа с контролируемой окружающей средой, чтобы проанализировать поведение раковых клеток в мозге.

В многофотонном режиме настройте лазер на подходящую длину волны. Сосредоточьтесь на опухолевой области, чтобы обнаружить флуоресценцию раковых клеток.

Определите z-стек для каждой позиции, чтобы получить несколько прижизненных изображений раковых клеток в разных оптических плоскостях.

Этот шаг позволяет захватывать значительную долю раковых клеток в опухолевом микроокружении, не влияя на разрешение клеток.

Впоследствии получайте изображения с разных положений опухоли в течение длительного времени.

Отслеживание пути раковых клеток в различных оптических плоскостях помогает определить индивидуальную миграцию опухолевых клеток с помощью подходящего программного обеспечения.

В подходящий момент времени эксперимента поместите мышь лицевой стороной вверх в коробку визуализации и установите 25-кратный водяной объектив в самое низкое z-положение. Добавьте крупную каплю воды в объектив и перенесите коробку с изображением в темную климатическую камеру микроскопа с температурой 37 градусов Цельсия.

Поднесите объектив к окну краниальной визуализации до тех пор, пока капля воды не коснется покровного стекла, и, используя режим эпифлуоресценции, наблюдайте за опухолью через окуляр, чтобы сфокусировать клетки.

Настройте лазер на нужную длину волны и выберите режим реального времени. Выбрав несколько интересующих точек для визуализации, запишите их координаты в программном обеспечении. Определите z-стек для каждой позиции, чтобы получить максимальный объем опухолевых клеток без ущерба для разрешения опухолевых клеток, с размером шага между изображениями, равным 3 микрометрам.

Затем получайте изображения объема опухоли в разных положениях каждые 20 минут в течение 2 часов, добавляя воду в объектив перед каждым получением изображения. После того, как будет получено последнее изображение, перенесите мышь на грелку с мониторингом до полного восстановления.