JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 3:05 мин • April 30th, 2023
В ответ на определенные химические аттрактанты, высвобождаемые солидными опухолями, иммунные клетки, такие как опухолеассоциированные макрофаги или ТАМ, проникают в солидные опухоли. Впоследствии эти ТАМ способствуют прогрессированию опухоли.
Чтобы изучить взаимодействие между TAMs и опухолевыми клетками in vitro, начните с использования многолуночного планшета с мембранным вкладышем. Такое расположение временно разделяет колодец на два отсека.
Далее добавляем суспензию ТАМов в верхний отсек трансвелла.
Дополните нижний отсек трансвелла кондиционированной средой, обогащенной химическими аттрактантами, секретируемыми опухолевыми клетками.
Инкубируйте тарелку в течение нужного времени.
Во время инкубации химические модуляторы привлекают ТАМ. Это приводит к перемещению ТАМ в нижний отсек через пористую мембрану-вставку через химически индуцированный хемотаксис.
Теперь извлеките вставку из лунки. Перенесите кондиционированную среду, содержащую миграционную популяцию TAM, в подходящую пластину для флуоресцентного измерения.
Обработайте клетки лизисным буфером, содержащим флуоресцентный краситель. Этот буфер лизирует макрофаги. В конце концов, молекулы красителя связываются с нуклеиновыми кислотами, производя усиленную флуоресценцию.
Наконец, отсканируйте планшет с помощью считывателя флуоресцентных пластин. Высокая флуоресценция указывает на успешную миграцию макрофагов через химический процесс, вызванный химическими веществами.
Для начала доведите необходимые материалы до комнатной температуры. Добавьте по 250 микролитров подготовленных ячеек МВ-4-11 в каждую вставку. Затем добавьте 400 микролитров кондиционированной среды/среды только в нижние камеры 24-луночного планшета, обязательно добавляя образцы в трех экземплярах.
Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 4 часов. Затем аккуратно постучите вставкой по внутренней стенке того же колодца и выбросьте вставку. Аккуратно пипетируйте клетки в лунках вверх и вниз три раза, чтобы перемешать.
Перенесите 225 микролитров этой клеточной суспензии в лунки 96-луночного планшета с черными стенками, пригодного для флуоресцентного измерения. После этого разбавьте краситель CyQuant буфером для лизиса 4x в соотношении 1:75. Кратковременно похлопайте и раскрутите раствор.
Перелейте по 75 микролитров этого раствора в каждую лунку 96-луночного планшета и выдерживайте при комнатной температуре в течение 15 минут. Используя считыватель флуоресцентных пластин, считайте флуоресценцию и проанализируйте данные, как указано в текстовом протоколе.