Анализ синтеза ДНК: метод оценки синтеза ДНК в пролиферирующих клетках с использованием включения радиоактивного тритиативного тимидина

Начните с использования многолуночного планшета, содержащего адгезивные клетки.

Обработайте эти клетки средой, содержащей тритиированный тимидин – радиоактивную версию тимидина – и инкубируйте.

Во время инкубации активно реплицирующиеся клетки включают радиоактивный тимидин. Этот тимидин образует пару напротив аденозина, генерируя радиоактивно меченую ДНК в пролиферирующих клетках.

Удалите отработанную среду из лунок. Добавьте буфер для лизиса, чтобы лизировать клетки и выпустить ДНК в суспензию.

Подготовьте сборку комбайна для ячеек, поместив сборные трубки комбайна над лунками микропланшета.

Приложите давление всасывания, чтобы обеспечить аспирацию взвешенной ДНК из лунок. Эта ДНК оседает на фильтровальной бумаге, образуя определенные пятна.

Вырежьте из фильтровальной бумаги чады с пятнами ДНК. Переложите эти чады по отдельности в сцинтилляционные флаконы.

Наложите на фильтровальную бумагу сцинтилляционный коктейль. Поместите флакон в счетчик сцинтилляции жидкости.

Внутри счетчика меченая ДНК излучает энергию за счет радиоактивного распада. Эта энергия поглощается компонентами сцинтилляционного коктейля. В конце концов, компоненты коктейля начинают передавать импульсы, которые, в свою очередь, поглощаются датчиком.

Количество обнаруженной радиоактивности определяет степень деления клеток.

Планшет 100 000 ячеек в тройных лунках в 24-луночном планшете. Через 46 часов добавьте тритиированный тимидин в питательную среду и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 часов.

Затем, после удаления среды, добавьте 300 микролитров предварительно подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы разбить клетки на части и высвободить ДНК. Затем включите комбайн и насос.

Поместите фильтровальную бумагу в комбайн для ячеек. Продолжайте собирать пробирки комбайна в пустой пустой лоток. Затем нажмите кнопку предварительной промывки, чтобы намочить фильтровальную бумагу. Поместите сборные трубки в лунки для отбора проб и приступайте к работе.

Используйте источник горячего света для сушки фильтровальной бумаги и разложите соответствующие флаконы на лотке. Выбейте в флаконы бумажные чады, а затем добавьте в каждый флакон по 2 миллилитра жидкого сцинтилляционного коктейля.

Инкубируйте флаконы в течение 1 часа в сцинтилляционном счетчике перед началом работы аппарата, чтобы получить количество подсчетов в минуту каждого образца, которое отражает активный синтез ДНК.