Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 4:02 мин. • April 30th, 2023
Нейросферы представляют собой неадгезивные сферические агрегаты нейральных клеток-предшественников или NPC.
При осаждении в определенных условиях адгезивного культивирования NPC могут спонтанно мигрировать из нейросферы.
Чтобы оценить миграционную реакцию NPC, сначала приготовьте суспензию NPC желаемой плотности в подходящей среде.
Затем высейте клеточную суспензию в питательную тарелку, содержащую среду, и инкубируйте.
Специфические факторы роста в среде поддерживают пролиферацию клеток. Кроме того, отсутствие подложки для покрытия удерживает клетки во взвешенном состоянии в среде, способствуя формированию трехмерных клеточных агрегатов, называемых нейросферами.
Достигнув нужного размера, соберите нейросферы.
Центрифугируйте и ресуспендируйте гранулу нейросферы в разбавленной среде.
Затем поместите суспензию нейросферы в пластину, покрытую внеклеточным матриксом, содержащую разбавленную среду, и инкубируйте.
Во время культивирования нейросферы прилипают к внеклеточному матриксу.
Со временем, благодаря составляющим внеклеточного матрикса, некоторые NPC начинают мигрировать из ядра нейросферы.
Теперь снимите носитель и зафиксируйте клетки.
Получение фазово-контрастных изображений нейросфер, демонстрирующих миграцию клеток.
С помощью подходящего программного обеспечения измерьте площадь общей нейросферы и внутреннюю массу клеток.
Наконец, вычтите площадь внутренней массы клетки из общей площади нейросферы, чтобы рассчитать среднюю миграцию NPC из нейросферы.
Чтобы сформировать нейросферу, пипетку 1 миллилитр среды 100% расширения в 35-миллиметровую чашку без какой-либо покрывающей подложки. Затем добавьте по миллиону нейральных клеток-предшественников в каждую из этих пластин и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48-96 часов.
Чтобы подготовить пластину к миграции нейросферы, растворите аликвоты ЭКМ-имитирующего геля в 6 миллилитрах среды расширения 30%. Добавьте 1 миллилитр ЭКМ-мимического геля с 30% расширяющей средой в одну лунку 6-луночного планшета. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Для тарелирования нейросфер с помощью пипетки собирают клетки в среду из 35-миллиметровой чашки и переносят их в коническую трубку. Затем вращайте трубку со скоростью 100 x g, чтобы гранулировать нейросферы. Затем повторно суспендируйте гранулу в 1-3 миллилитрах предварительно подогретой среды с 30% расширением.
Затем пипетку 200 микролитров ресуспендированных нейросфер в 6-луночный планшет, содержащий ЭКМ-имитирующий гель с 30% расширяющей средой, и покачайте планшет. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов. Аспирируйте ЭКМ-мимический гель с 30% расширяющей средой, а затем фиксируйте клетки в течение 30 минут с помощью 4% параформальдегида.
Чтобы проанализировать нейросферы, захватывайте изображения с использованием настроек фазового контраста при 10-кратном увеличении. Используйте программное обеспечение NIH ImageJ для измерения средней миграции нейросфер. В ImageJ используйте инструмент «Линия от руки», чтобы обвести внешний контур нейросферы.
Затем используйте функцию measure для вычисления площади трассировки и трассировки внутренней массы ячейки сферы. Вычтите внутреннюю клеточную массу из общей площади нейросферы, чтобы количественно оценить среднюю миграцию.