Выделение астроцитов: метод получения чистого препарата кортикальных астроцитов мыши

Культура астроцитов in vitro помогает исследовать биологическую роль астроцитов – наиболее распространенных клеток мозга.

Начните с изучения мозга новорожденной мыши, помещенного под препарирующий микроскоп.

Удалите обонятельные луковицы и мозжечок.

Выполните разрез по средней линии между двумя полушариями, чтобы разделить кору головного мозга.

Удалите мозговые оболочки, чтобы избежать контаминации в культуре астроцитов фибробластами и менингеальными клетками.

Перенесите полушария коры головного мозга в ледяную среду и пропустите через мясорубку на мелкие кусочки.

Соберите кусочки коры головного мозга в пробирку, содержащую трипсин. Трипсин, фермент протеазы, переваривает белки клеточной адгезии, способствуя разделению клеток.

Центрифуга для гранулирования переваренной ткани.

Удалите надосадочную жидкость и добавьте в гранулу астроцитарную среду. Энергично пипеткайте для высвобождения смешанной клеточной популяции астроцитов, микроглии и клеток-предшественников олигодендроцитов или OPC.

Поместите эту клеточную суспензию в колбу для культуры тканей, покрытую полилизином, и инкубируйте.

Отрицательно заряженные клетки присоединяются к положительно заряженному полилизину и разрастаются по всей поверхности, образуя сливающийся слой.

Встряхните колбу, чтобы отделить слабо связанную микроглию и OPC. Удалите надосадочную жидкость, содержащую оторвавшиеся клетки.

Добавьте трипсин в слой астроцитов. Соберите ячейки и центрифугуйте.

Повторно суспендируйте гранулу и разделите астроциты на несколько колб.

Наконец, оцените чистоту культуры астроцитов путем иммуноокрашивания клеточно-специфических маркеров.

Перенесите чашку с мозгами в стереомикроскоп. Затем, чтобы изолировать кору головного мозга, захватите задний конец каждого мозга тонкими щипцами и выполните разрез по средней линии между полушариями.

Затем вставьте второй набор щипцов в созданную канавку и отделите пластинчатую структуру коры от остальной части мозга.

После того, как все коры головного мозга будут изолированы, осторожно отсоедините мозговые оболочки от коры головного мозга, потянув за них тонкими щипцами. На этом этапе можно избежать контаминации окончательной культуры астроцитов менингеальными клетками и фибробластами.

Переложите подготовленные корковые полусферы во вторую посуду, наполненную охлажденным HBSS, и выложите на лед. Продолжайте соответственно со всеми четырьмя кортикальными отложениями. Наконец, разрежьте каждую полусферу на четыре-восемь небольших кусочков с помощью острых лезвий.

В стерильных условиях перенесите кусочки коры головного мозга в одну 50-миллилитровую пробирку Falcon и добавьте HBSS до конечного объема 22,5 миллилитров. Затем добавьте 2,5 миллилитра 2,5% трипсина.

Установите крышку на место, перемешайте и выдержите салфетку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Перемешивайте, встряхивая каждые 10 минут. Затем, после центрифугирования в течение 5 минут при 300 х г для гранулирования кусочков ткани коры головного мозга, осторожно сцедите надосадочную жидкость.

Добавьте 10 миллилитров астроцитарной среды к грануле и используйте пипетку объемом 10 миллилитров для энергичного пипетирования среды, содержащей ткань, вверх и вниз от 20 до 30 раз до получения одноклеточной суспензии.

Затем добавьте среду для покрытия астроцитов до конечного объема 20 миллилитров и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток в соответствии со стандартными процедурами.

Один препарат из четырех коры детенышей мыши должен дать от 10 до 15 умножить на 10 до шестой части диссоциированных одиночных клеток. Наконец, аспирируйте поли-D-лизин из заранее приготовленной колбы и перенесите диссоциированную клеточную суспензию в колбу.

Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур в течение 2 дней, а затем смените среду. После этого носители следует менять каждые 3 дня.

Астроцит должен сливаться с вышележащим слоем микроглии через 7-8 дней в культуре. На этом этапе установите колбу T75 на орбитальный шейкер со скоростью 180 оборотов в минуту в течение 30 минут, чтобы удалить микроглию.

Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую микроглию, или открутите ее вниз и подложите на тарелку для посева. Затем добавьте 20 миллилитров свежей среды для культивирования астроцитов и продолжайте встряхивать колбу со скоростью 240 об/мин в течение 6 часов, чтобы удалить клетки-предшественники олигодендроцитов.

Поскольку некоторые OPC не полностью отделяются от слоя астроцитов, продолжайте энергично встряхивать рукой в течение 1 минуты, чтобы предотвратить загрязнение OPC. Опять же, выбросьте надосадочную жидкость или поставьте ее на тарелку, чтобы культивировать OPC.

Оставшийся сливающийся слой астроцитов дважды промойте PBS. Аспирируйте PBS и добавьте 5 миллилитров трипсина-ЭДТА. Инкубировать в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия.

Проверяйте отслоение астроцитов каждые 5 минут и усиливайте отслоение астроцитов, ударяя колбой по ладони два-три раза.

Как только астроциты отделятся от колбы, добавьте 5 миллилитров питательной среды для астроцитов. Вращайте клетки при давлении 180 x g в течение 5 минут, аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 40 миллилитров свежей астроцитарной среды.

Из одной колбы Т75 смешанных клеток коры головного мозга должно получиться примерно 1 умножить на 10 до шестой клетки, обогащенной астроцитами, после первого пассажа.