Культура эндотелиальных клеток из микрососудов головного мозга крысы: процедура выделения и культивирования эндотелиальных клеток из микрососудов головного мозга крысы

Чтобы изолировать эндотелиальные клетки мозга, сначала перенесите собранный мозг крысы в чашку, содержащую охлажденный буфер

.

После удаления мозжечка и зрительных нервов разделите мозг на полушария головного мозга. Затем отделите средний мозг от переднего.

Удалите мозговые оболочки и миелин-содержащее белое вещество из переднего мозга, оставив позади кору головного мозга для изоляции микрососудов.

Затем гомогенизируйте кору головного мозга, чтобы разрушить нервную ткань и составляющие ее компоненты.

Центрифугируйте гомогенат для удаления клеточного мусора и миелина.

Затем обработайте тканевую гранулу коктейлем для пищеварения, содержащим ферменты коллагеназу, диспазу и дезоксирибонуклеазу.

Коллагеназы и диспазы переваривают внеклеточный матрикс, который встраивает микрососуды, отслаивая фрагменты микрососудов от ткани. Дезоксирибонуклеазы разрушают любую свободную ДНК, высвобождаемую из лизированных клеток.

Смешайте желаемый объем разложенного гомогената с соответствующей средой с градиентом плотности и центрифугойте.

Отбросьте миелин и верхний верхний слой, содержащий паренхиматозные клетки мозга, а затем надосадочную жидкость.

Теперь обработайте микрососудистую гранулу коктейлем для пищеварения, чтобы полностью освободить фрагменты микрососудов, состоящие из эндотелиальных клеток и перицитов.

Центрифугируйте суспензию. Ресуспендируйте фрагмент микрососуда, содержащую гранулу, в подходящую среду с добавлением пуромицина - антибиотика.

Засейте суспензию во внеклеточный матрикс, покрытый белком, и инкубируйте.

Фрагменты микрососуда прилипают к покрытию в пластине. Пуромицин избирательно устраняет перициты, в то время как компоненты среды способствуют пролиферации эндотелиальных клеток.

Извлеките мозг из черепа трех 5-недельных крыс Вистар и перенесите мозги в чашку Петри, наполненную холодным буфером для вскрытия, который держат на льду.

Рассекайте мозг без мозжечка и зрительных нервов. Затем разрежьте каждый мозг пополам, чтобы разделить два полушария головного мозга.

Под стереомикроскопом сделайте еще один разрез для удаления среднего мозга и перенесите все передние мозги в чистую чашку Петри на льду с диссекционным буфером.

Затем перенесите одно переднее полушарие в новую чашку Петри, заполненную буфером для холодной диссекции. Удерживайте его зажимом и осторожно отделите мозговые оболочки от краев переднего мозга.

После этого переверните передний мозг и осторожно снимите мозговые оболочки, не разрывая их. Убедитесь, что передний мозг очищен от мозговых оболочек и перережьте оставшуюся часть зрительных нервов. Цель этого шага заключается в том, чтобы удалить одеяло из белого вещества для получения оболочки коры головного мозга.

Начните с зажима переднего мозга по краю, а затем осторожно проведите щипцами по поверхности, стараясь не разорвать поверхность коры.

Затем убедитесь, что мозг свободен от мозговых оболочек, перевернув его, чтобы убедиться, что в нем нет остаточных оболочек или больших поверхностных сосудов.

Затем, начиная с извлечения трех мозгов из черепа, полное время вскрытия не должно занимать более 2 часов для сохранения тканей и выживания клеток. Перенесите кору головного мозга трех головных голов в 6 миллилитров буфера для холодной диссекции в 7-миллилитровый гомогенизатор Dounce.

Затем диссоциируйте кору головного мозга 10 движениями вверх и вниз первым пестиком с большим зазором, а затем 10 движениями вверх и вниз вторым пестиком с меньшим зазором.

Затем перелейте 6 миллилитров суспензии в новую 50-миллилитровую трубку Falcon и промойте гомогенизатор Dounce 24 миллилитрами буфера для холодной диссекции. Разделите суспензию на три пробирки Falcon, чтобы получить эквивалент одной коры на пробирку.

После этого центрифугируйте при 1000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Наблюдение за гранулой показывает градиент розового цвета, который представляет собой микрососудистую часть гомогената коры головного мозга.

Теперь выбросьте надосадочную жидкость и гомогенизируйте гранулу из одной коры 1 миллилитром ферментативного раствора, содержащего смесь коллагеназ, диспазы, ДНКазы 1-го типа и гентамицина.

Поместите трубки в шейкер на 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем смешайте 1 миллилитр дигеста с 10 миллилитрами 25% BSA/HBSS 1X и аккуратно перемешайте пробирки. Затем разделите их центрифугированием, зависящим от плотности, при давлении 3600 x g в течение 15 минут при комнатной температуре.

После центрифугирования, зависящего от плотности, гранула содержит микрососуды, а верхний диск содержит миелин, паренхиму мозга и остаточные микрососуды.

Осторожно переложите верхний диск и надосадочную жидкость в чистые 50-миллилитровые пробирки Falcon; следите за тем, чтобы не отсосать микрососудистую гранулу.

Аккуратно согните

пробирку и повторите центрифугирование в зависимости от плотности. Во время этого второго центрифугирования держите полученную гранулу, содержащую микрососуды, при температуре 4 градуса Цельсия.

После второго центрифугирования, зависящего от плотности, осторожно выбросьте верхний диск и надосадочную жидкость. Смешайте и повторно суспендируйте полученные гранулы, содержащие микрососуды, из обоих центрифугий с 1 миллилитром холодного HBSS 1X.

Далее промойте микрососуды 20 миллилитрами холодного HBSS 1X и центрифугируйте при 1000 х г в течение 5 минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость, стараясь не потерять микрососуд с гранулами.

Гомогенизируйте гранулу микрососуда из одной коры 1 миллилитром того же ферментативного раствора, следуя за мягким вихрем трубок. Далее перевариваем микрососуды в течение 1 часа при 37 градусах Цельсия в шейкере. После этого смешайте переваренные микрососуды из трех кор головного мозга в одну пробирку.

Снова разделите смесь на две 50-миллилитровые пробирки Falcon, чтобы получить микрососуды, извлеченные из эквивалента полутора коры головного мозга на пробирку. Затем центрифугируйте при давлении 1000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.

Непосредственно перед покрытием микрососудов возьмите из инкубатора две колбы с покрытием Т75 и отсасывайте излишки покрытия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте микрососуд в 1 миллилитре ЭКМ.

Доведите каждую пробирку до 10 миллилитров с ЭХМ с добавлением 4 микрограммов на миллилитр пуромицина, чтобы начать процесс очистки, и проложите микрососуды в колбе.

Затем поместите колбы в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы обеспечить адгезию микрососудов к коллаген-фибронектиновой матрице

.