Выделение клеток мозга из личинок рыбок данио-рерио: метод получения интактных нейронов, макрофагов и микроглии из ткани мозга рыбок данио

Мозг рыбки данио состоит из нейронов - нервных клеток, которые играют заметную роль в обработке информации. Кроме того, он включает в себя популяцию поддерживающих иммунных клеток, включая макрофаги и микроглии, которые населяют межнейронное пространство.

Чтобы выделить все эти типы клеток мозга у рыбки данио, сначала возьмите личинок данио-рерио под наркозом в чашке Петри, содержащей соответствующие среды.

Визуализируйте рыбку данио под стереомикроскопом и пересеките головы личинок над желточным мешком, чтобы сохранить мозг в целости.

Переложите вырезанные головки в гомогенизатор, наполненный предварительно охлажденным материалом, помещенный на лед. Низкая температура помогает предотвратить деградацию клеток мозга.

С помощью пестика гомогенизируйте ткани мозга рыбок данио. Гомогенизация разрушает внеклеточный матрикс и инициирует диссоциацию нейронов, макрофагов и микроглии от ткани мозга.

Этот этап также отделяет миелин - богатый липидами изолирующий слой - от нейронов.

Пропустите гомогенат через ситечко, чтобы захватить большие скопления клеток.

Центрифугируйте фильтрат для гранулирования клеток и фрагментов миелиновой оболочки. Выбросьте загрязнениесодержащее надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте гранулу в среде с соответствующим градиентом плотности и накройте ее буфером.

Крутите трубку вниз с низкой скоростью. Более легкие фрагменты миелина образуют четкую полосу на границе буферной и градиентной среды, в то время как более плотные клетки располагаются на дне.

Отсасывайте верхние слои и ресуспендируйте клетки мозга в свежих средах для дальнейшего использования.

Добавьте 1,5 миллилитров 15 миллимоллярного трикаина на 50 миллилитров средней до 50 личинок для приготовления анестезии. Затем с помощью 3-миллилитровой пастеровской пипетки перенесите 10 личинок за раз в 55-миллиметровую чашку Петри, наполненную ледяной средой Е3 с трикаином, чтобы окончательно обезболить их.

Под стереомикроскопом выровняйте 10 личинок в центре чашки Петри. Затем с помощью хирургических ножниц пересекают личиночные головки над желточным мешком.

С помощью 3-миллилитровой пастеровской пипетки возьмите все головки и с минимальным количеством жидкости переложите их в стеклянный гомогенизатор на лед, содержащий 1 миллилитр ледяной среды А.

Заменяйте каждую маленькую чашку Петри, содержащую ледяной E3 плюс трикаин, на новую каждые 30 минут, чтобы убедиться, что пересечение выполняется в холодной среде E3 плюс трикаин.

Замените ледяной фильтрующий материал А в стеклянном гомогенизаторе, когда цвет начнет тускнеть. После того, как вся группа головок будет собрана, удалите все среды А из стеклянного гомогенизатора и замените их 1 миллилитром свежей ледяной среды А.

Когда гомогенизатор все еще находится на льду, используйте плотно прилегающий пестик, чтобы разрушить ткань мозга, выполнив 40 раундов дробления и оборотов для 3-5 личинок dpf и 50 раундов для 7 и 8 личинок DPF.

Затем добавьте в клеточную суспензию 2 миллилитра среды А, чтобы разбавить клетки и уменьшить их агломерацию миелином. Устраните клеточную агломерацию, пропустив клеточную суспензию через клеточный фильтр плотностью 40 микрон в холодную 50-миллилитровую соколиную пробирку на льду. Повторите этот шаг три раза.

Переложите 1 миллилитр клеточной суспензии в холодные 1,5-миллиметровые пробирки, и вращайте их при 300 х г и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем с помощью 10-миллилитрового шприца с иглой 23G x 1" удалите надосадочную жидкость.

С помощью 1 миллилитра ледяной среды 22% плотности градиента, аккуратно покрытой 0,5 миллилитрами ледяной среды 1x DPBS, аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу. Вращайте трубки с частотой 950 x g без перерыва и медленным ускорением при 4 градусах Цельсия в течение 30 минут.

После отжима отбросьте среду с градиентом плотности DPBS и миелин, захваченный на границе раздела. Затем используйте 0,5 миллиметра среды A с 2% NGS для промывки клеток и вращайте пробирки при температуре 300 x g при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Удалите как можно больше надосадочной жидкости, затем соберите клеточные гранулы из одного и того же экспериментального состояния в 1 миллилитре среды А с 2% NGS.

Если интересующие клетки экспрессируют флуоресцентный белок, пропустите клеточную суспензию через 35-микронный колпачок клеточного фильтра и перенесите их в холодные 5-миллилитровые пробирки FACS на льду, защищенном от света.