Генерация индуцированных нейральных стволовых клеток (iNSCs) из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs): процедура на основе вируса Сендай для перепрограммирования PBMNC в iNSCs

Чтобы перепрограммировать соматические клетки в индуцированные нейральные стволовые клетки или iNSCs - стволовые клетки, обладающие высокой способностью к самообновлению и дифференцировке, начните с культивирования мононуклеарных клеток периферической крови в среде, не содержащей сыворотки, для расширения эритробластов.

Далее пипеткой поместите суспензию эритробласта в культуральный планшет. Обработайте клетки рекомбинантным вирусом Сендай или SeV. Эти вирусы кодируют перепрограммирование транскрипционных факторов. Центрифуга для осаждения клеток и инкубации.

После слияния SeV с мембраной клетки-хозяина геном вируса подвергается транскрипции с последующей трансляцией в цитоплазме. Эктопическая экспрессия транскрипционных факторов запускает процесс перепрограммирования клетки без интеграции генов в геном хозяина.

Теперь центрифугируйте культуру, чтобы удалить вирусы. Ресуспендируйте трансдуцированные клетки в подходящей среде с последующим нанесением покрытия. Далее, центрифугу для удаления клеточного мусора. Ресуспендируйте клетки в среде iNSC.

Затем засейте клетки в пластину, покрытую белком. Клетки прикрепляются к белковой оболочке в пластине. Дополняйте адгезивные клетки средой iNSC через день. После недели культуры ежедневно заменяйте отработанные носители свежими носителями iNSC.

Факторы роста и химические составляющие в среде поддерживают самообновление и поддерживают плюрипотентность подмножества трансдуцированных клеток, полностью перепрограммируя их на iNSCs. Со временем клетки начинают образовывать колонии iNSC. Выберите нужные колонии для выращивания.

В день 0 соберите клетки в среду MNC и переложите в 15-миллилитровую коническую пробирку. После центрифугирования клеток при 200 х г в течение 5 минут отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки 1 миллилитром предварительно подогретой среды МНК. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью Trypan Blue, а затем повторно суспендируйте их предварительно нагретой средой MNC до концентрации 200 000 клеток на лунку в 24-луночных планшетах.

Разморозьте пробирки, извлеченные из хранилища с вирусом Сендай при температуре минус 80 градусов Цельсия, на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5-10 секунд, а затем дайте им оттаять при комнатной температуре. После размораживания сразу же положите их на лед. Добавить размороженный вирус Сендай в лунки 24-луночной пластины с МНК при кратности заражения 10. Чтобы облегчить прикрепление клеток, центрифугируйте планшеты при 1000 х г в течение 30 минут, а после этого поместите пластины в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа.

В 1-й день перенесите клетки со средой в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Чтобы еще больше отделить оставшиеся ячейки, промойте лунки 1 миллилитром среды MNC на лунку и добавьте ячейки со средой в пробирку. После центрифугирования этой клеточной суспензии при 200 х г в течение 5 минут аспирируют надосадочную жидкость, ресуспендируют клетки 500 микролитрами свежей предварительно подогретой среды ТНК и добавляют в лунку 24-луночного планшета.

Во 2-й день используйте 1 миллилитр на лунку предварительно разведенного 50 мкг на микролитр поли-D-лизина и D-PBS для покрытия 6-луночных планшетов в течение не менее 2 часов при комнатной температуре. Аспиратируйте поли-D-лизин из 6-луночных планшетов и высушите на вертикальном чистом скамейке около 10 минут. Затем добавьте 1 миллилитр на лунку предварительно разведенного 5 микрограммов на миллилитр ламинина в 6-луночные планшеты и инкубируйте от 4 до 6 часов при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы покрыть. Перед использованием вымойте пластины с помощью D-PBS.

На 3-й день все МНК вируса Сендай трансдуцировали в индуцированной среде нейральных стволовых клеток на 6-луночных планшетах, покрытых поли-D-лизином ламинином. На 5 и 7 день аккуратно добавьте 1 миллилитр предварительно подогретой при температуре 37 градусов Цельсия среды iNSC в каждую лунку из 6-луночных планшетов.

С 9 по 28 день ежедневно заменяйте среду свежей предварительно подогретой средой iNSC. Следите за появлением колоний iNSC и примерно через 2-3 недели выберите колонии с соответствующей морфологией, используя обожженные стеклянные пипетки. Затем перенесите каждую колонию в отдельную лунку с 6-луночной пластиной для расширения.